Что такое праймер,применяемый в строительстве, и какова его функция? Большинство людей, так или иначе столкнувшихся в своей жизни с ремонтом или строительством, знают, что это специальная грунтовка, применяемая в различных видах строительных работ. Ее используют в качестве основы перед нанесением покрытия, для обеззараживания стен и потолка, избавления от плесени и грибка, для обезжиривания стен и различных поверхностей перед укладкой плитки и кафеля. В продаже можно найти как уже готовые к применению смеси, так и концентраты, которые нужно разводить.

Праймеры бывают нескольких видов, их название зависит от материала основы. Как полагают опытные люди, экономить на использовании праймера лучше не стоит, так как качественно подготовленная поверхность - это залог успешного проведения ремонта любого объекта.

Что такое праймер эпоксидный?

Эпоксидный праймер, или грунтовка по металлу, является необходимым материалом для обеспечения надежной антикоррозионной защиты черных и цветных металлов. Качественные грунты наполняются особыми антикоррозионными пигментами, которые способны при нанесении грунта на металл проникать в его структуру, образуя надежную долговременную защиту.

Этот вид грунтовки используется для обработки различных видов поверхностей, таких как дерево, бетон, металл, железобетон, асбоцемент при кровельных и теплоизоляционных работах. Его можно применять как в качестве самостоятельного гидроизолирующего продукта, так и в сочетании с другими самоклеющимися и материалами.

Также он используется для антикоррозионной защиты различных металлов.

Что такое праймер полиуретановый?

Используется для укрепления пористых и слабых оснований, увеличивая адгезию к основанию перед применением полиуретановых, полимерцементных, эпоксидных покрытий. Обладает низкой вязкостью. применяют на бетонных и цементных смесях, металле, дереве, штукатурке, керамике и кирпиче. Прекрасно подходит для защиты металлов от коррозии. Может быть использован при низких температурах.

Лидирующие позиции среди производителей современных кровельных, теплоизоляционных и занимает компания "Технониколь", выпускающая также различные виды высококачественных грунтовок. Праймер "Технониколь" занимает одно из лидирующих мест среди аналогичных материалов из-за удачного соотношению цены и качества. Благодаря тому, что при его производстве используются только качественные битумы и растворители, этот праймер имеет высокие технические качества, такие как высокая проникающая способность, короткое время высыхания и повышенная теплостойкость.

Например, "Технониколь", цена которого в различных магазинах колеблется от 650 до 1500 рублей, имеет массу положительных отзывов от профессиональных строителей различных крупных компаний, занимающихся возведением зданий и загородных домов.

Праймеры от "Технониколь" обеспечивают особо прочное приклеивание любых гидроизоляционных материалов даже к пыльным, шероховатым и пористым поверхностям, что значительно облегчает дальнейшую работу строителям.

ДНК фага М13 в двухцепочечную репликативную форму для синтеза коротких сегментов РНК в точке начала репликации используется РНК-полимераза-холофермент (рис. 2.27). Нри репликации других одноцепочечных кольцевых фаговых ДНК (G4) РНК-праймер синтезируется специальной 

    Для синтеза ДНК необходима РНК-затравка, которую называют праймером. Обычно затравка содержит от 10 до 60 нуклеотидов и синтезируется РНК-полимеразой на родительской ДНК, используя ее как матрицу. 

Праймер-опосредованная прогулка (Блуждающая затравка) 

Были рассмотрены два примера выбора главного параметра осаждения в условиях получения осадка Mg(0H)2 вариантами периодического процесса, осуществляемого методом приливания. В первом праймере роль главного параметра выполняет мольное соотношение реагентов, во втором - затравка осадком. Сравнение воздействия рассматриваемых параметров на свойства 

При амплификации с помощью ПЦР используют два олигонуклеотидных праймера (затравки), фланкирующие интересующий нас участок ДНК процесс амплификации заключается в повторяющихся циклах температурной денатурации ДНК, отжига праймеров с комплементарными последовательностями и последующей достройки полинуклеотидных цепей с этих праймеров ДНК-полимеразой (рис. 1). Праймеры ориентированы таким образом , что синтез с помощью полимеразы , протекает только между ними, удваивая количество копий этого участка ДНК. 

Рис. 2.16. Репликация двухцепочечной ДНК. При деспирализации ДНК возникает промежуточная разветвленная структура (репликативная вилка). Обе одиночные цепи ДНК имеют противоположную полярность (5 -+ 3 и 3 5). ДНК-полимеразы способны катализировать синтез только в одном направлении (5 З). Поэтому синтез одной цепи может происходить непрерывно в направлении продвигающегося раскручивания двойной спирали . Другая же цепь должна синтезироваться в обратном направлении . Синтез начинается с образования короткого отрезка РНК, служащего затравкой (праймером) (у бактериофага Т7 это основания А-С-С-А). Затем ДНК-полимераза осуществляет синтез цепи ДНК длиной в 1000-2000 нуклеотидов, примыкающей к этой РНК. В конце концов РНК-праймер удаляется экзонуклеазой, брешь заполняется ДНК-полимеразой (й) и закрывается ДНК-лигазой (б). Такой механизм дробного, или прерывистого, синтеза ДНК с последующим связыванием отдельных отрезков позволяет объяснить репликацию ДНК на антипараллельной цепи.

    После завершения синтеза фрагмента Оказаки РНК-затравка (праймер) удаляется (нуклеотид за нуклеотидом) с помощью 5 - 3 -экзонуклеазной активности ДНК-полимеразы I. По мере отщепления рибонуклеотидных мономеров каждый из них замещается на соответствующий дезоксирибонуклеотид в ходе полимеразной реакции , осуществляемой ДНК-полимеразой I (при этом в качестве затравки используется З -конед предыдущего фрагмента Оказаки). Новый фрагмент Оказаки присоединяется к отстающей цепи ДНК с помощью фермента ДНК-лигазы. для этой реакции у эукариот служит АТФ. ДНК-лигаза не может соединить две молекулы одноцепочечной ДНК. Цепи ДНК, соединяемые ДНК-лигазой, должны быть частью двухцепочечной молекулы ДНК. 

Праймаза [синтез РНК-затравки (праймера)] 

Поначалу тот факт, что отстающая цепь ДНК синтезируется не непрерывно, представлялся весьма удивительным, поскольку неясно было, откуда всякий раз берутся новые затравки (праймеры). Как известно, для работы ДНК-полимеразы необходимо наличие З -ОН-затравки, без которой фермент не способен направлять рост цепи . Так, очищенная ДНК-полимераза оказывается абсолютно неактивной в смеси, содержащей кольцевую одноцепочечную ДНК фага фХ174 в качестве матрицы и необходимые субстраты. В то же время, как мы знаем, РНК-полимераза может инициировать синтез РНК по одноцепочечной ДНК-матрице в отсутствие какой бы то ни было затравки. 

С того момента, как возникла репликационная вилка , для ДНК-полимеразы, синтезирующей ведущую цень, всегда есть спаренный 3 -коиец- необходимый ей для того, чтобы начать синтез новой цепи . Иначе обстоит дело с ДНК-полимеразой, ответственной за синтез отстающей цени. Ей требуется всего каких-нибудь 4 с для того, чтобы синтезировать один короткий фрагмент ДНК, после чего она должна переключиться на синтез совсем другого фермента на новом участке матричной цепи , расположенной на некотором расстоянии от первого (см. рис. 5-39). Для этого ей всякий раз нужна затравка со спаренным З -концом, а следовательно, нужен и механизм, способный производить такие затравки. В этот механизм входит фермент, называемый ДНК-праймазой. Она синтезирует из рибонуклеозидтрифосфатов короткие РНК-затравки (праймеры), состоящие у эукариот примерно из 10 нуклеотидов (рис. 5-42). Эти затравки синтезируются с определенными интервалами на матрице для отстающей цепи здесь их наращивает ДНК-нолимераза, начиная, таким образом , всякий раз новый фрагмент Оказаки . Молекула ДНК-полимеразы продолжает это наращивание до тех пор, пока она не достигнет РНК-затравки. присоединенной к 5 -концу предыдущего фрагмента ДНК. Чтобы обеспечить образование непрерывной цепи ДНК из многих таких фрагментов, в действие вступает особая система репарации ДНК, быстро удаляющая РНК-затравку и заменяющая ее на ДНК. Завершает процесс ДНК-лигаза, соединяющая З -конец нового фрагмента ДНК с 5 -концом предыдущего фрагмента (рис. 5-43). 

ДНК-полимераза 6 (дельта) не способна инициировать синтез новых цепей ДНК, она может лишь удлинять уже имеющуюся нуклеотидную цепь -затравку (праймер). Роль затравки выполняет РНК, синтезируемая специальным ферментом ДНК-по-лимеразой а (альфа). Каждый праймер состоит примерно из 10 нуклеотидов. 

На каждой из одноцепочечных цепей репликативной вилки происходит синтез новых цепей , но не одинаково. Различия связаны с тем, что матричные цепи расположены антипараллельно, а синтез новых цепей возможен только с их З -конца. Рассмотрим сначала синтез той цепи, которую называют лидирующей (см. рис. 4.5). Прежде всего , в месте расхождения цепей образуется затравка (праймер), которая представляет собой короткий (около 10 нуклеотидов) полирибонук-леотид (РНК, не полидезоксирибонуклеотид), комплементарный матричной цепи. Синтез затравки осуществляет фермент праймаза (ДНК-полимераза а). Затем З -конец затравки начинает расти уже за счет присоединения дезоксирибонуклео-тидных остатков при участии ДНК-полимеразы 6. Удлинение ведущей цепи происходит непрерывно по мере перемещения репликативного комплекса вдоль матричной цепи ДНК. 

Оказывается, новосинтезированные цепи ДНК всегда содержат на 5 -конце несколько рибонуклеотидов. Иными словами, сннтеэ ДНК начинается с синтеза РНК- РНК-затравку для синтеза ДНК образует специальный фермент, называемый ДНК-праймазой (от англ. праймер - затравка). Праймаза может быть отдельны. 1 ферментом, как у бактерий, илн входить в качестве субъединицы в ДНК-полимеразу (как у ДНК-полимеразы а животных). В любом случае праймаза - это фермент, отличный от РНК-полимераз, синтезирующих разнообразные клеточные РНК и тоже способных инициировать синтез новых полинуклеотидных цепей (см. гл. VII). Почему же в таком случае для инициации цепей ДНК используются рибонуклеотиды Возможное объяснение состоит в том, что в ходе эволюции прай.чазы произошли из РНК-полимераз. Но есть и другое, функциональное, объяснение. Поскольку требования инициа- 

Получены доказательства, что образование каждого фрагмента Оказаки требует наличия короткого затравочного комплементарного праймера - участка РНК, синтез которого катализируется праймазой. Затем при участии ДНК-полимеразы П1 синтезируются длинные участки ДНК. РНК-затравки далее вырезаются при участии ДНК-полимеразы I, а свободные места их (бреши) замещаются (достраиваются) комгшементарными дезоксирибонуклеотидами под действием той же ДНК-полимеразы I наконец, сшивание разъединенных участков отстающей цепи осуществляется при помощи ДНК-лигаз. Подобный механизм челночного синтеза ДНК легко объясняет фактические данные о накоплении коротких фрагментов ДНК у Е. oll во время репликации ДНК. 

Евроген предоставляет сервис по секвенированию плазмид и ПЦР-фрагментов на автоматическом секвенаторе. При соблюдении оптимальных условий возможно прочтение до 800 нуклеотидов за прогон. Регулярно получаемая дальность прочтения - 500-600 нуклеотидов.

Специалисты с многолетним опытом секвенирования:

Проведут секвенирование в короткие сроки
- помогут вам подобрать правильные праймеры для секвенирования
- выделят плазмиды и почистят ПЦР-фрагменты
- предоставят отредактированный сиквенс в текстовом формате
- в случае, когда нужно прочесть протяженную вставку или ПЦР-фрагмент
подберут и синтезируют необходимые праймеры для следующих раундов сиквенса

Результаты секвенирования (хроматограммы и отредактированный текстовый файл) вы получите по электронной почте.

Для того, чтобы ваш заказ был принят и выполнен в срок, заполните, пожалуйста, форму заказа (xls) и отправьте ее нам по электронной почте и приложите распечатанный вариант формы к образцам.

Для получения удовлетворительных результатов мы рекомендуем соблюдать следующие требования к предоставляемым материалам и образцам:

Праймеры

Температура отжига праймера должна находиться в интервале 58-62°С. Концентрация праймеров для сиквенса - 5 пикомоль/мкл, на один сиквенс требуется 5 мкл раствора праймера. Если вы предоставляете специфические праймеры для секвенирования, нам необходимо знать их нуклеотидные последовательности.

Если у вас нет нужных праймеров, вы можете заказать любой праймер для секвенирования в нашей компании.

Мы также располагаем для часто используемых плазмидных векторов.

ВНИМАНИЕ! ПРАЙМЕРЫ К ОБРАЗЦАМ ДОБАВЛЯТЬ НЕ НУЖНО!

Плазмиды

Для постановки одной реакции секвенирования необходимо не менее 6 мкл раствора очищенной плазмиды с минимальной концентрацией 50 нг/мкл для плазмиды длиной 3-5 т.п.н. и 100 нг/мкл для плазмиды длиной 6-9 т.п.н. , для плазмид больших размеров – просьба уточнить необходимые объемы и концентрации. При выделении и очистке плазмид для секвенирования, рекомендуем использовать протокол, приведенный на нашем сайте , воспользоваться коммерческими наборами реактивов для выделения плазмид, или заказать выделение плазмидной ДНК из культуры клеток в нашей компании.

Продукты ПЦР

Для постановки одной реакции секвенирования необходимо не менее 6 мкл раствора, содержащего очищенный целевой продукт с концентрацией 20-50 нг/мкл, в зависимости от длины фрагмента. При очистке продукта ПЦР-реакции рекомендуем использовать коммерческие наборы реактивов или заказать очистку в нашей компании.

Отправка образцов

Образцы для секвенирования и растворы праймеров к ним пересылаются почтой или курьерскими службами при комнатной температуре или замороженными (по желанию заказчика).
Образцы можно также передать на вахту Технопарка ИБХ с 9 до 21 в рабочие дни.

НЕ ТРЕБУЕТСЯ ДОБАВЛЕНИЯ К ОБРАЗЦАМ ЭТИЛОВОГО СПИРТА!

Вниманию заказчика

В случае невозможности исполнения заказа, возникшей по вине заказчика (например, неверно предоставленной информации о нуклеотидной последовательности, присланных некачественных биологических материалах), произведенные услуги подлежат оплате в полном объеме.

Конфиденциальность

Евроген гарантирует сохранение конфиденциальности данных, полученных в процессе выполнения и обсуждения заказа.

Нуждается в двуцепочечном участке, выступающем в качестве затравки. Такие затравочные молекулы ДНК, называемые праймерами, в настоящее время представляют собой химически синтезированные олигонуклеотиды с определенной последовательностью оснований. Ранее, когда химический синтез был весьма дорог и ограниченно доступен, в качестве затравочных молекул использовались преимущественно короткие олигонуклеотиды, протяженностью 10-12-13 звеньев , а также рестриктазные фрагменты ДНК-вектора, прилегающие к сайту клонирования вставки. Одним из главных недостатков таких биологических праймеров были их чрезмерная длина, следствием чего являлось уменьшение количества "читаемых" нуклеотидов с одного геля. Рекомендовалось даже проведение дополнительного этапа рестрикции после отжига самого праймера и завершения терминирующих реакций . В случае, если сайт узнавания рестрикционной эндонуклеазы, использованной для приготовления биологического праймера и расположенный на его 3"-конце в процессе построения новой цепи восстанавливался, праймер можно было исключить полностью из электрофоретического разделения. В противном случае было необходимо использовать какой-либо пригодный сайт рестрикционной эндонуклеазы внутри праймера (если таковой имелся). Протяженный праймер предлагалось также удалять обработкой щелочью или РНКа-зой после введения на его 3"-конец рибонуклеотида . Есть примеры использования в качестве затравочной молекулы всей последовательности клонирующего вектора pBR322 . В описываемом примере вставка была клонирована по сайтам рестрикци-онных эндонуклеаз EcoRl и HindlU и для осуществления отжига, приводящего к секвенированию самой вставки, рекомбинантная плазмида расщеплялась рестрикционной эндонуклеазой EcoRI, а исходный вектор - HindlU. По завершению терминирующих реакций был обязателен этап расщепления полученных продуктов ферментов HindUl, чтобы удалить векторный фрагмент.

Другим типом биологических праймеров, не получившим широкое распространение, являлись довольно короткие структуры (до 13 звеньев), синтезируемые с помощью полинуклеотидфосфорилазы Е. coli . Данный фермент в бактериальной клетке ответственен за перенос рибонуклеотидных остатков от рибо-нуклеозид-5"-дифосфатов в олиго- или полирибонуклеотидам, однако при определенных условиях он может в качестве донора и акцептора использовать и дезоксирибонуклеотидные производные.

Обычно сами исследователи готовили для своих экспериментов определенные праймеры путем расщепления какого-либо клонированного фрагмента ДНК с установленной рестриктазной картой соответствующими рестрикционными эндонуклеазами с последующей очисткой полученных фрагментов. Однако некоторые биологические праймеры были доступны из коммерческих источников. Так, фирма "Bethesda Research Laboratories" (США) поставляла биологические двуцепочеч-ные праймеры длиной 24 пн и 96 пн. 96 пн фрагмент ДНК представлял из себя субклонированный в плазмидном векторе pBR325 исходный 92 пн EcoRI-Alul участок вектора M13mp2 . Также для секвенирования вставок в фаговом векторе M13mp2 был предложен относительно короткий биологический 24 пн EcoRl-BamHI праймер (общей протяженностью 30 пн), 6 нуклеотидов которого на 5"-конце не имели гомологии с ДНК матрицы . Для большего удобства авторами цитируемой статьи этот праймер был клонирован по сайтам рестрикционных эндонуклеаз EcoRl и ВатHI в плазмидном векторе pBR322.

Другим общим недостатком биологических праймеров являлась их изначальная двуцепочечная структура и, следовательно, имеющая место конкуренция за отжиг с комплементарной цепью праймера и матрицей ДНК. Для исключения такой конкуренции необходимо было прибегать к такой весьма трудоемкой процедуре, как деление цепей ДНК праймера денатурирующим гель-электрофорезом. Происходящее восстановление двуцепочечной структуры биологических праймеров во время этапа отжига на стадии проведения терминирующих реакций ДНК-полимеразой приводило к их мечению и в результате на радиоавтографе во всех дорожках выявлялись жирные полосы, соответствующие праймеру. В то же время следует отметить, что в некоторых случаях при использовании двуцепочечных матриц такие праймеры в виде рестриктазных фрагментов ДНК позволяли осуществить секвенирование обеих цепей .

Кроме биологических праймеров, в литературе встречается упоминание о праймерах, как бы синтезируемых самой ДНК-полимеразой в процессе удлинения исходного праймера . Данные праймеры представляли собой некий гибрид синтетического универсального праймера (о котором речь пойдет ниже) и биологического. Так, в результате построения второй цепи ДНК Кленовским фрагментом ДНК-полимеразы I с использованием в качестве затравки универсального праймера образовывались двуцепочечные участки ДНК, протяженность которых зависела от времени инкубации. После этого предлагалось, зная рестриктазную карту клонированного фрагмента ДНК, расщеплять вновь построенный двуцепочечный участок соответствующими рестрикционными эндонуклеазами и уже далее проводить непосредственно само секвенирование в виде терминирующих реакций. Следует отметить, что о подобном подходе говорилось и ранее , но в силу своей трудоемкости и плохой воспроизводимости он не нашел широкого распространения.

Совершенствование химического синтеза олигонуклеотидов и его удешевление привели к тому, что биологические праймеры были практически полностью вытеснены из процесса секвенирования ДНК за исключением каких-то особых случаев. Разработанная Мессингом и со-авт. система для секвенирования ДНК в одноцепочечном фаге М13 включала и синтетический универсальный праймер длиной 15 нуклеотидов с последовательностью 5"-CCCAGTCACGACGTT-3", участок отжига которого был локализован внутри 1асZI региона, располагаясь за 17 нуклеотидов до полилинкерного участка . (Несовпадение указанного количества нуклеотидов до полилинкера с рис. вызвано тем, что те вектора, разработанные Мессингом и соавт., не содержали участок, несущий промотор фага Т7.) Поскольку все вектора серий М13 и pUC несли в своем составе lacZI регион, то, как следствие, они имели и участок для отжига данного праймера, названного поэтому универсальным. Предложенный способ секвенировать вторую цепь клонированного фрагмента ДНК в одноцепочечном векторе серии М13 привел к необходимости разработать новый, в то время более редко используемый праймер, названный обратным, и расположенный с противоположной стороны полилинкера . Позднее была разработана и поставлялась разными фирмами целая линейка аналогичных праймеров (как прямых, так и обратных), несколько различающихся своим расположением относительно полилинкера, как это видно из рис. 2.9 для прямых праймеров. С созданием фагмидных векторов, унаследовавших от своих предшественников данный lacZI участок, оба типа праймеров приобрели равноценное значение. Так, прямой, или фор-вард-праймер, используются с фагмидами, образующими фаговые частицы с (+)-цепью вектора, тогда как обратный, или реверс-праймер, -с (-)-цепью. Добавление участков фаговых промоторов ТЗ, Т7 или SP6, фланкирующих полилинкер, позволило разработать специальные праймеры для их отжига на этих участках, так как они были расположены несколько ближе к клонированному фрагменту ДНК, чем стандартные универсальный прямой и обратный. Наличие полилинкеров большой протяженности в векторах серии pBluescript заставило фирму "Stratagene" (США) предложить новые SK- и KS-праймеры, отжигающиеся непосредственно на по л и линкере.

Менее универсальный набор из семи праймеров был разработан для плазмидного вектора pBR322 . Эти праймеры представляли собой гомологичные последовательности для участков, фланкирующих некоторые основные сайты узнавания гексануклеотид-ных рестрикционных эндонуклеаз, таких как EcoRI, HindIII, ВатIII, SalI и PstI и в настоящее время поставляются рядом фирм для секвенирования разных цепей ДНК. Для определения пригодности праймера к секвенированию той или иной цепи ДНК они указываются относительно рестриктазной карты вектора как по часовой, так и против часовой стрелок.

Разработка различных стратегий секвенирования ДНК, и дальнейшее усовершенствование химического синтеза олигонуклеотидов легли в основу стратегии секвенирования, названной подходом с использованием внутренних или прогрессивных праймеров, или праймерной "прогулкой" . Поскольку данная стратегия требует, кроме универсального праймера, использования и специально синтезированных праймеров, гомологичных "прочитанным" участкам ДНК, то существует необходимость постоянного синтеза все новых и новых олигонуклеотидов. Вся забота, которую должны проявлять экспериментаторы по отношению к универсальным праймерам для секвенирования, так это только беспокоиться об их постоянном наличии в лаборатории, что можно обеспечить как специальным синтезом того или иного праймера или приобретением их из различных коммерческих источников (первое, впрочем, значительно дешевле). Что касается праймеров для секвенирования ДНК праймерной "прогулкой" (или, правильнее сказать, ее классическим вариантом), то здесь выбор каждого праймера индивидуален и в связи с этим надо придерживаться некоторых правил, кратко рассмотренных ниже.

Нуклеотидная последовательность фрагмента ДНК, в пределах которой предполагается выбрать участок для синтеза праймера, должна быть уверенно "прочитана". Следует исключить сомнительные последовательности, допускающие их неоднозначное "прочтение". Преследуя цель синтеза минимального количества праймеров, необходимых для завершения определения нуклеотидной последовательности протяженного фрагмента ДНК, надо располагать новый праймер возможно близко к 5"-концу уже известной последовательности, но, как правило, чтобы его 3"-конец находился не ближе 20-50 нуклеотидов от края. Конкретное расположение места для отжига праймера во многом зависит и от особенностей самой последовательности ДНК, где надо принимать в расчет и ее GC-состав, и возможные повторяющиеся элементы, и участки со значительной (потенциальной) вторичной структурой. Не последнюю роль при выборе праймера играет и температура отжига синтезируемых олигонуклеотидов, которая обычно рекомендуется в пределах 40°-50°С при предполагаемой использовании в качестве ДНК полимеразы секвеназы в 60°-70°С для термостабильных ДНК-полимераз. Кроме GC-состава, температура отжига праймеров в значительной степени зависит и от их длины, обычно выбираемой в пределах 15-22 нуклеотидов. Для более точного определения температуры плавления олигонуклеотидов в расчет принимаются не только сами основания, но и их ближайшее окружение, что может быть проведено с помощью специализированных компьютерных программ, подробнее рассмотренных в соответствующей главе. Однако грубый подсчет температуры плавления праймеров может быть проведен вручную с помощью следующей формулы:

Tm = 4°C(G + С) + 2°С(А + Т) - 5°С,

Хотя, считается, что данная формула справедлива лишь для относительно коротких праймеров длиной до 20 звеньев.

В литературе встречаются рекомендации при выборе длины секвенирующих праймеров исходить из стандартной длины в 18 нуклеотидов для праймера с 50%-ным GC-составом и прибавляя по одному звену с понижением GC-состава на каждые два процента . В то же время эти авторы сообщают об успешном применении различных 17-мерных праймеров, с содержанием G- и С-нуклеотидов от 2 до 9 для секвенирования АТ-богатого генома Clostridium aceto-butylicum .

Исходя из теории вероятности встречаемости отдельных участков нуклеотидной последовательности разной протяженности в ДНК, можно считать, что уже 15-мерный праймер будет (при условии его 100%-ной гомологии с мишенью) уникальным для генома человека, оцениваемого обычно в 3х10 9 пн. Вторым условием является непринадлежность данного олигонуклеотида к каким-либо повторяющимся элементам генома. Таким образом, вероятность фальш-праймирования данными олигонуклеотидами такой протяженности с какого-то другого места генома крайне низка. В то же время нельзя не учитывать возможность отжига праймера с не полностью спарившимися основаниями, что как раз может привести к фальш-праймированию. Чтобы хоть как-то уменьшить вероятность этого, необходимо провести анализ уже известной последовательности секвенируемого фрагмента ДНК и самого вектора, уделяя максимальное внимание выявлению участков 100%-ной гомологии с последними 5-7 нуклеотидами праймера на его 3"-конце. В случае все же "нечитаемого" радиоавтографа геля, ввиду наличия в матрице ДНК дополнительных мест отжига праймера, повышение температуры отжига праймера теоретически может помочь преодолеть эту проблему. В противном случае необходимо синтезировать новый праймер с другой последовательностью.

Весьма опасным может быть формирование шпилечных структур внутри самого праймера и образование димеров праймеров, 3"-концы которых образуют прочные связи. Примеры таких праймеров приведены ниже на рис.

Как видно из рис., для праймера А характерно значительное присутствие комплементарных нуклеотидов на 3"-конце. По всей вероятности для части праймерных молекул (этот процесс не относится к абсолютно количественным и даже при одной и той же температуре олигонуклеотиды могут существовать в разных вариантах) такая структура может сохраниться во время этапа отжига и, таким образом, определенное количество праймера будет не способно служить в качестве затравки для ДНК-полимеразы. Так, для первого праймера существуют различные варианты образования димерных молекул, два из которых (А1 и А2) характеризуются достаточно прочной структурой, чтобы существовать в растворе во время этапа отжига данного олигонуклеотида на матрице ДНК. Результатом этого могут явиться более слабые сигналы с радиоавтографа геля. Что касается варианта A3, то его существование крайне маловероятно. Для праймера Б, незначительно отличающегося по своей последовательности от праймера А, приведенные возможные димеры при температуре отжига, скорее всего, существовать не будут.

Кроме образования димеров, для праймера А возможно предсказать образование внутримолекулярной шпилечной структуры, изображенной на рис.. Такая достаточно прочная структура также способна исключить часть праймера из реакции отжига на матрице ДНК и соответственно ухудшить конечные результаты.

Особый тип праймеров для секвенирования ДНК представляет собой короткая двуцепочечная молекула ДНК, состоящая из двух комплементарных олигонуклеотидов, сконструированных так, что при их отжиге друг на друга образуется несколько выступающих нуклеотидов (обычно 4 или 5) на 3"- или 5"-конце. Данная короткая молекула ДНК за счет образующегося таким образом так называемого липкого конца при помощи ДНК-лигазы лигируется с комплементарным ему концом матрицы ДНК, образованным под действием соответствующей рестрикционной эндонуклеазы. В дальнейшем участок самого лигированного олигонуклеотида служит местом для отжига секвенирующего праймера (которым может быть один из данных комплементарных олигонуклеотидов) . В другом варианте при лигировании праймерной двуцепочечной молекулы ДНК специально формируется "ник" на границе этих фрагментов ДНК, с которого и начинается построение новой цепи или за счет смещения прежней цепи ДНК или ее удаления 5" → 3"-экзонуклеазной активностью ДНК-полимеразы . Также было найдено интересное решение по объединению в одной молекуле праймера и линкера, получившего название сплинкер (splinker - sequencing primer linker) . Особенностью такого сплинкера было то, что его последовательность содержала внутренний участок гомологии, что при определенной температуре приводило к формированию вторичной структуры в виде "шпильки" с выступающим или тупым концами.

Из рис. на котором приведен пример такого сплинкера, видно, что данный олигонуклеотид может существовать также и в форме "шпильки" с выступающим на 5"-конце нуклеотидами, пригодными для их лигирования с подобными же. Необходимым элементом сплинкера является наличие в его двуцепочечном участке доступного сайта узнавания относительно редкошепящей рестрикционной эндонуклеазы, позволяющей на определенном этапе удалить концевую петлю.

Даже самый малый (обычный) масштаб синтеза олигонуклеотидов в 0,05 мкмоль (существуют синтезаторы с масштабом синтеза и 0,03 мкмоль) позволяет синтезировать в тысячи раз превышающее количество олигонуклеотидов, используемых в качестве затравки в реакциях секвенирования. Остаток праймера, как правило, больше нигде не применяется, что крайне не экономно. Данное обстоятельство заставляло искать какие-то новые варианты стратегии секвенирования ДНК праймерной "прогулкой".

Весьма существенное влияние на дальнейший процесс совершенствования праймеров для секвенирования протяженных фрагментов ДНК праймерной "прогулкой" оказала статья Штудиера , в которой впервые говорится о необходимости существования предсинтезированной библиотеки олигонулеотидных праймеров. В данной статье был проведен подробный анализ теоретически возможных частот встречаемости праймеров разной длины в случайной ДНК, клонированной в космидах. (Под случайной ДНК здесь понимается ДНК с приблизительно равным соотношением всех четырех нуклеотидов в одной цепи и не содержащей блоков каких-либо простых повторов.) Были проанализированы праймеры длиной от 6 до 12 нуклеотидов и показано, что 8-мерные праймеры вполне пригодны для их использования в качестве затравок, тогда как ранее считалось, что секвенирующий праймер должен быть не короче 15-17 нуклеотидов. Что касается 6- или 7-мерных праймеров, то они также могут служить в качестве затравок, но для них, как правило, имеются множественные участки отжига на анализируемой в цитируемой работе рекомбинантной космиде (общей длиной около 45 тпн) и поэтому такие короткие праймеры не пригодны для целей секвенирования. Вероятность наличия уникальных единичных сайтов в рекомбинантной космиде для окта-, нона- и декамеров значительно выше и, исходя из этого, Штудиер предположил, что существование библиотеки из 5900 октануклеотидных, 8400 нонануклеотидных и 26000 декануклеотидных праймеров будет вполне достаточным для осуществления проекта секвенирования генома человека. Экономический расчет показал, что стоимость таких праймеров будет составлять очень незначительную долю стоимости всего процесса секвенирования ввиду того, что для каждой секвенирующей реакции необходима 1/1000 или даже 1/10000 часть синтезированного праймера.

Однако синтез библиотеки праймеров такого размера все равно был невозможен и в связи с этим проводился более тщательный анализ секвенирующих праймеров на предмет сокращения их общего количества. Было продемонстрировано высокое качество секвенирования ДНК с использованием октануклеотидных праймеров . Авторы считают, что нет необходимости в синтезе и применении для секвенирования рекомбинантной ДНК, клонированной в плазмидных векторах, полной библиотеки октамеров, состоящей из 65536 вариантов, а вполне можно обойтись 1000 вариантов, причем среди них не должно быть участков, гомологичных обычным векторным последовательностям, палиндромным участкам или праймеров с очень низким GC-составом.

Хотя и существует возможность праймирования ДНК гекса- и даже пентануклеотидными праймерами, они образуют множественные участки связывания с ДНК матрицы и поэтому как единичные праймеры не пригодны для секвенирования. Несмотря на то, что была показана принципиальная возможность использования в качестве затравки октануклеотидных праймеров, все же их частота встречаемости в случайной ДНК не позволяет считать их достаточно уникальными. В этом отношении нонамерные праймеры являются более предпочтительными и как показано рядом авторов, минимально возможно короткими для эффективного секвенирования ДНК. Однако, полная библиотека 9-мерных праймеров должна уже состоять из 262 144 различных вариантов (4 9) и содержать 2 359 296 нуклеотидных звеньев. Синтез такого количества праймеров нереален и поэтому ряд исследователей пошли по пути компьютерного анализа всех теоретически возможных вариантов 9-меров, с тем чтобы сильно ограничить число действительно пригодных и необходимых . Так, этими авторами была предложена библиотека всего из 3342 нонамерных праймеров. Проведенный компьютерный анализ на предмет распределения всех этих праймеров по всей длине клонированных фрагментов ДНК крупного размера из генома человека с известными нуклеотидными последовательностями, имеющимися на тот момент в 63-м выпуске Генбанка, общей протяженностью около 800 тпн показал их довольно равномерное распределение и пригодность для секве-нирования ДНК с помощью подхода праймерной "прогулкой". Столь сильное ограничение числа нонамерных праймеров было достигнуто за счет ряда следующих требований предъявленных к этим праймерам. Так, предполагалось расположение на 3"-конце праймера G или С нуклеотидов и в соседней позиции А или Т нуклеотидов; общий GC-состав должен быть в пределах от 45 до 60%; не должно быть полинуклеотидных повторов (таких как А А, СС, GG, ТТ); не должно быть ди-нуклеотидных повторов (например, GCGCGCGC); и, наконец, праймер не должен быть гомологичен каким-либо коротким повторяющимся элементам, широко представленным в геномах различных организмов, как, например A/w-повторам. Разработанный компьютерный алгоритм с этими заложенными требованиями выдал последовательности 3342 нонамерных праймеров, удовлетворяющих всем этим условиям. Однако авторы признавали, что и этот размер библиотеки праймеров все же великоват. Позднее они ограничили размер подобной библиотеки праймеров до всего 2391 варианта, но при этом, к сожалению, не указали, за счет каких дополнительных ограничений им это удалось сделать . В этой работе авторы провели не только компьютерный анализ, но и осуществили определение нуклеотидных последовательностей двух клонированных фрагментов ДНК общей протяженностью около 15 тпн с помощью 59 праймеров из разработанной ими библиотеки в 2391 нонамерный праймер.

Другим подходом для секвенирования ДНК праймерной "прогулкой" с помощью коротких предсинтезированных праймеров явилось составление 12-, 18- или даже 24-членных праймеров из библиотеки гексануклеотидных фрагментов посредством их лигирования после отжига встык на одноцепочечной матрице ДНК (рис. 2.13) .

Серьезным преимуществом данного процесса, получившего название SPEL-6 (Sequential Primer Elongation by Ligation with 6-mers), стал относительно небольшой размер библиотеки гексануклеотидных праймеров, равный всего 4 6 = 4096. После низкотемпературного лигирования 6-меров на матрице ДНК и их превращения в полноразмерный праймер с этого участка шло построение новой цепи ДНК, тогда как при повышении температуры непролигировавшие 6-членныё фрагменты диссоциировали с матрицы ДНК. Еще меньшую библиотеку из всего 1024 гексануклеотидных праймеров удалось создать за счет использования вырожденных по одному нуклеотиду праймеров и успешно применить ее для секвенирования ДНК . Эти авторы показали, что 18-мерный (3 гексануклеотидных фрагмента) праймер формируется за 10 мин лигированием отожженных встык на матрице ДНК данных 6-меров. В дальнейшем этими же авторами был проведен детальный анализ условий лигирования и секвенирования ДНК с помощью SPEL-6 подхода . Было показано, что лигирование 6-членных праймеров носит кооперативный характер и лучшие результаты по секвенированию с помощью лигированных на матрице ДНК праймеров обнаружили 18-60 нуклеотидные праймеры, составленные из 3-10 гексамерных фрагментов. Более длинные праймеры позволили лучше преодолеть проблемы, связанные со вторичной структурой. Различная эффективность и некоторые особенности лигирования гексамеров выявились при использовании ДНК лигазы фага Т4 и термостабильной ДНК лигазы Rodothermus marinus. Так, Rm-лигаза требовала не менее 6 гексануклеотидных фрагментов, но при этом, как было выяснено, не нуждалась, в отличие от Т4 ДНК-лигазы, в SSB-белке. Последнее весьма важно, так как удаление этого, иногда добавляемого в реакцию и способствующего лигированию, белка перед электрофоретическим разделением секвенируемых образцов представляет значительную проблему .

Пригодность SPEL-6 подхода для автоматического секвенирования флуоресцентно меченной ДНК была продемонстрирована разными авторами . Интересно отметить, что последние авторы обнаружили высокую пригодность лигированных гексамерных праймеров для целей секвенирования ДНК праймерной "прогулкой" и только один такой лигированный праймер показал плохой результат. Контрольное секвенирование этого участка с помощью соответствующего обычного 18-мерного праймера, синтезированного в олигонуклеотидном синтезаторе, показало, что и он также оказался не способен однозначно определить последовательность этого участка ДНК (Lodhi, McCombie, 1996].

Был предложен интересный способ создания 12-, 18-, 24- или 30-мерных праймеров путем лигирования в растворе коротких гексамерных блоков с помощью Т4 или Т7 ДНК лигаз . Такие блоки для лигирования подбирались так, что каждый из них образовывал по три комплементарные пары оснований с двумя другими. Особенностью этого комплекса праймеров являлось то, что фосфатные группы на 5"-конце, необходимые для лигирования, несли лишь гексамерные блоки, располагающиеся на одной цепи. В результате лигирования и последующей денатурации образовывались полноценные 12-, 18-, 24- или 30-нуклеотидные праймеры и не пролигированные 6-меры от противоположной цепи (рис.). Авторы обнаружили, что более эффективное лигирование гексануклеотидов и формирование, например, 18-звенного олигонуклеотидного праймера за счет существующих стэкинг-взаимодействий происходит при условии образования шестью ге-ксамерами выступающих комплементарных концов, способных к отжигу друг с другом, приводящему к увеличению общей протяженности отрезка двуцепочечнои сегментированной ДНК. Ранее этой же группой исследователей был предложен способ создания сегментированного праймера из пула гексануклеотидных фрагментов путем их тандемного отжига на матрице ДНК .

Главным отличием от SPEL-6 подхода здесь явилось то, что гексануклеотидные фрагменты ДНК не лигировали между собой и они удерживались на матрице ДНК с помощью SSB-белка, а также за счет стэкинг-взаимодействий между соседними нуклеотидными основаниями из разных 6-меров (рис.). Независимо и почти одновременно с данной работой Улановским и соавт. было проведено детальное исследование особенностей праймирования ДНК с помощью так называемых модульных праймеров . Отдельными модулями служили пентамер-ные, гексамерные, гептамерные и октамерные праймеры. Используемые поодиночке пентамерные и гексамерные праймеры образуют множественные участки праймирования, однако они же в составе сегментированного праймера (например, 5 + 5 + 7 или 6 + 6 + 6 или 6 + 8) отжигаются в уникальных местах как если бы они представляли собой цельный праймер и вполне пригодны для секвенирования. Проявляющийся кооперативный эффект заключается в том, что для каждого модуля повышается температура ассоциации/диссоциации при наличии соседних праймеров-модулей. Авторам удалось исключить использование нежелательного SSB-белка и отдельные модули при этом взаимодействуют друг с другом за счет стэкинг-взаимодействия. Как известно, пурин-пуриновые взаимодействия прочнее вариантов с другими нуклеотидами и, таким образом, соседние модули, несущие в своих граничных участках пурины, в большей степени пригодны для секвенирования ДНК с помощью таких модульных праймеров. Две проанализированные этими авторами ДНК-полимеразы обнаружили некоторые различия при использовании одних и тех же модульных праймеров в качестве затравок. Дальнейшее развитие семейство модульных праймеров получило в следующей работе этой же группы авторов . В цитируемой работе модульные праймеры составлялись из пред синтезированной библиотеки в тысячу 5-и 7-мерных олигонуклеотидов. Сложным нововведением явилось то, что для гептануклеотидных праймеров, предназначенных быть или средними, или задними блоками составного модульного праймера во время химического синтеза, специально добавлялась фосфатная групп к 3"-концу. Это исключало нежелательное построение цепи от этих неосновных модулей. Проблема выявления другого, вновь синтезированного фрагмента ДНК от среднего модуля, оказавшегося в силу каких-то причин крайним, не возникала при использовании в качестве метки радиоактивного фосфора на 5"-конце основного модуля. Однако при другом способе введения метки, в частности флуоресцентной метки для автоматического секвенирования, это приобретает серьезное значение. Следует отметить, что с целью уменьшения предсинтезированной библиотеки гептамеров (16384 или 4 7 теоретически возможных) два последних нуклеотида на 5"-конце синтезировались как вырожденные. Авторы данной статьи, исходя из своего опыта, отмечают, что неудачными праймерами оказываются те, которые характеризуются весьма низким GC-составом или в их состав входят модули, несущие только один G- или С-нуклеотиды или вообще не несущие оных, причем включая вырожденные участки, состоящие всего из одного или двух типов нуклеотидных оснований, не имеющие Pu/Pu-участков, образующих стэкинг-взаимодействия на границе 5-мерного переднего модуля и следующего за ним гептамерного. Таким образом, если исключить олигонуклеотидные модули с нежелательными параметрами, то библиотеки 5- и 7-меров могут быть ограничены по 500 вариантов для каждого типа праймеров.

Заинтересовавшись обнаруженным эффектом образования единственного уникального места отжига модульного праймера, тогда как используемые поодиночке составляющие его пентамерные и гексамерные праймеры образуют множественные участки праймирования, эта же группа авторов провела специальное исследование, направленное на выяснение механизмов этого процесса . Различные комбинации модульных и цельных праймеров с разным количеством фермента показали наличие эффекта конкуренции за "захват" молекулы фермента комплексами матрица-затравка, причем с заметным преимуществом более протяженных модулей. Практический вывод из результатов этой работы заключается в неиспользовании значительных количеств ДНК-полимеразы при секвенировании с помощью модульных праймеров, ввиду опасности образования множественных участков отжига и построения с них новых комплементарных цепей ДНК.

Значителен вклад российских ученых в разработку сегментированных праймеров для секвенирования ДНК праймерной "прогулкой". Свердловым и соавторами получены интересные результаты по секвенированию ДНК с помощью трех пентамерных праймеров, образующих последовательные дуплексы с матрицей ДНК [Ажикина и др., 19936; Azhikina et al., 1993]. Преимуществом использования библиотеки пентамерных праймеров для секвенирования ДНК праймерной "прогулкой" является довольно малый размер последней. Так, полная библиотека всех возможных пентануклеотидов состоит всего из 1024 (4 5) вариантов. Особенностью данных пентамеров (m 5 C)(m 5 C)(am 2 A)GT, G(am 2 A)(m 5 C)GG и (am 2 A)(am 2 A)(am 2 A)(am 2 A)(m 5) (где m 5 C - 5-метилдезоксицитидин, am 2 A - 2-аминодезоксиаденозин) было то, что они содержали модифицированные цитозиновые и адениновые основания, что способствовало большей прочности образуемых дуплексов, как это было показано в их предыдущей работе [Ажикина и др., 1993а]. Исследованные температуры плавления (Tпл) дуплексов, образованных ДНК фага М13mp18, обычным 17-мерным праймером и двумя другими, характеризующимися разным набором модифицированных оснований, заметно различались. Так, для модифицированного праймера 5"-CTAAAACGACGGCCAGT-3" Тпл была равна 68 °С, тогда как для несущего только модифицированные цитозины она была уже 73 °С и для полностью модифицированного данного праймера по всем цитозинам и аденинам одновременно Тпл составила 78 °С. Подобное увеличение Тпл происходит за счет того, что аминогруппа 2-аминодезоксиаденозина участвует в образовании третьей водородной связи в А-Т паре, тогда как при образовании двойной спирали дополнительная метальная группа 5-метилцитозина попадает в большую бороздку ДНК [Ажикина и др., 1993а]. Использование всех этих 17-мерных праймеров в секвенировании ДНК показало, что модифицированные праймеры приводят к образованию более сильных сигналов, что может иметь важное значение для экономии реагентов. Было также выявлено, что степень модификации праймеров прямо коррелирует с величиной сигнала на рентгеновской пленке [Ажикина и др., 1993а].

Анализ различных факторов, влияющих на эффективность праймирования ДНК короткими модифицированными праймерами, расположенными встык на матрице ДНК, показал, что наиболее критичным является прочность связывания сегмента, расположенного на 3"-конце . Этой же группой авторов проведено исследование особенностей распределения гексануклеотидов вдоль матрицы ДНК с помощью электронного микроскопа . Ранее ими же была предложена схема взаимодействия матрицы, затравочной молекулы и ДНК-полимеразы, заключающаяся в том, что сама молекула фермента выполняет активную роль в образовании данного комплекса [Ажикина и др., 19936]. Так, в цитируемой работе авторы предположили, что стабильность инициирующего комплекса формируется как взаимодействием затравки с матрицей, так и вкладом самой ДНК-полимеразы, причем для разных ДНК-полимераз он может различаться, оставаясь при этом весьма значительным.

Еще более короткие блоки, состоящие из модифицированных тетрануклеотидов, были применены Кнорре и соавт. в качестве сегментированных праймеров для секвенирования ДНК [Кнорре и др., 1996]. Проведенное ими исследование эффективности праймирования такими составными праймерами из четырех модифицированных феназинием тетрануклеотидных блоков показало в отдельных случаях результаты, сравнимые с таковыми при использовании стандартного универсального праймера. Причем наилучшие результаты были получены с праймером, у которого только два блока из четырех несли производные феназиния 5"-PhnGTAA PhnAACG ACGG CCAG-3". Следует отметить, что данный составной прай-мер является укороченным (на один нуклеотид) вариантом 17-мерного универсального праймера. Продемонстрированная возможность использования таких коротких модифицированных модулей в качестве секвенирующих праймеров позволяет создать относительно небольшую библиотеку предсинтезированных олигонуклеотидов, состоящую всего из 256 (4 4) вариантов, причем феназиниевые производные тех или иных тетрамеров, не зависящие от их последовательности, могут готовиться по мере надобности. Этим данный подход обеспечивает дополнительное преимущество перед модифицированными пентамерами, полученными Ажикиной и соавт. [Ажикина и др., 19936; Azhikina et al, 1993], поскольку последние (пента-меры) могут нести только модифицированные аденины и цитозины.

Интересным подходом к секвенированию ДНК праймерной "прогулкой" является способ ферментативного дифференциального удлинения короткого праймера с помощью неполного набора дезоксинуклеотид-трифосфатов, получившего наименование DENS (Differential Extension with Nucleotide Subsets) . Сущность данного способа заключается в том, что октануклеотидный праймер отжигается на предполагаемой к секвенированию матрице ДНК сразу в нескольких местах, но в результате ограниченного построения новой цепи только в тех местах, где на матрице будут находиться нуклеотиды комплементарные добавленным в реакционную смесь дезоксинуклеотидтрифосфатам, будет происходить удлинение праймера. Следующий этап проведения терминирующих реакций при повышенной температуре (60 °С) приведет к диссоциации с матрицы неудлиненных 8-мерных праймеров и, таким образом, при построении новой цепи множественных вновь синтезированных фрагментов ДНК образовываться не будет (рис.).

Важность DENS-механизма праймирования заключается в том, что октануклеотидные праймеры служат гораздо лучшей затравкой, чем любые более короткие модульные праймеры. Хотя, как отмечают авторы, DENS-механизм праймирования в сочетании с гептамерными модульными праймерами дает еще лучший эффект (естественно, первым праймером на 3"-конце служит октануклеотидный). Все же полная библиотека октануклеотидных праймеров слишком велика (65536 или 4 8) и авторами предложено использовать октануклеотидные праймеры с двумя полностью вырожденными нуклеотидами на 5"-конце, что позволяет резко ограничить число возможных вариантов данных октануклеотидов . Авторы считают, что вероятность наличия второго дополнительного сайта отжига данного праймера, где он также будет удлинен в ферментативной реакции хотя бы на 5 нуклеотидов (что может оказаться достаточным для дальнейшего праймирования при высокой температуре) весьма низка и составляет для клонированных в плазмидах фрагментов ДНК длиной 7-10 тпн всего около 10%. Что касается векторной молекулы, то зная ее последовательность, такую возможность множественного праймирования с ней можно исключить, так как при секвенировании ДНК праймерной "прогулкой" обычно существует достаточно большой выбор участков среди уже секвенированной ДНК в качестве дальнейших праймеров с отличающейся последовательностью для удлинения самого праймера этим способом. Другой возможностью является выбор той или иной смеси дезоксинуклеотидтрифосфатов (А + С; А + G; А + Т; С + G; С + Т и G + Т), наиболее оптимально подходящих к каждому конкретному случаю. Еще одним приложением DENS-механизма удлинения праймеров является возможность использования коротких 8-мерных олигонуклеотидов в циклическом секвенировании, где только на втором этапе используется термостабильная ДНК-полимераза . Подобное применение обычных модульных праймеров в циклическом секвенировании невозможно из-за их преждевременной диссоциации с матрицы ДНК при повышении температуры.

Отдельную группу затравочных молекул представляют собой так называемые вырожденные праймеры, составленные или на основе известного участка аминокислотной последовательности какого-либо белка, или на основе относительно консервативной последовательности нуклеотидов какого-либо гена из мультигенного семейства или ортологичного гена. В качестве примера можно привести некий условный участок аминокислотной последовательности Asp Gin Glu His Lys и соответствующий ему вырожденный праймер GAY-CAR-GAR-CAY-AAR. Показано эффективное использование подобных праймеров для скрининга бактериальных колоний на предмет конкретных вставок и их последующее секвенирование . Известно, что разные аминокислоты кодируются неодинаковым числом триплетов и поэтому для выбора подобных праймеров необходимо стремиться выбирать такие блоки аминокислот, для которых будет характерна минимальная вырожденность. Однако в случае неизбежного присутствия в выбранном участке аминокислот, кодируемых большим числом триплетов, такой праймер будет представлять собой весьма гетерогенную смесь олигонуклеотидов. Применение остатков инозина, образующего комплементарные пары с любым из четырех дезоксинуклеотидов, в вырожденных местах таких праймеров в значительной степени решает эту проблему . Использование таких праймеров с инозином вместо вариабельных нуклеотидов показало их высокую пригодность для секвенирования ДНК . Сообщается также о синтезе праймеров для секвенирования ДНК и ПЦР, содержащих или 3-нитропиррол, или 5-нитроиндол в качестве универсальных оснований .

Как уже отмечалось выше, для успешного секвенирования ДНК ферментативным методом необходимо осуществить отжиг затравочной молекулы на матрице ДНК в строго определенном месте. Последнее достигается как правильным подбором последовательности самого праймера, точного его синтеза и последующей очистки (если необходимо), так и определенной температурой отжига. В ранних рекомендациях предлагалось смесь одноцепочечной ДНК и двуцепочечного (биологического) праймера подвергать кипячению в течение 3 мин и затем выдерживать при температуре 65°С в течение 60-120 мин. Более короткие синтетические праймеры отжигали на матрице ДНК в течение 30-60 мин при температуре около 55°-65°С. Позднее стал применяться подход с постепенным понижением температуры отжига посредством помещения пробирки с матрицей ДНК и специфическим праймером в стакан с водой (100-150 мл), нагретой до 65°С, давая ей возможность произвольно остыть до 30°С. Отжиг более коротких (8-12 мерных), а также сегментированных или модульных праймеров требует понижения температуры даже до 3°-5°С.

Завершая рассмотрение различных олигонуклеотидных праймеров, следует упомянуть о предъявляемых требованиях к их качеству. Праймеры являются довольно критичным компонентом секвенирующих реакций. Как уже отмечалось выше, "читабельность" радиоавтографа геля или однозначность результатов, получаемых в автоматическом секвесторе ДНК, будет зависеть от гомогенности 5" -конца праймера. Поскольку при химическом синтезе олигонуклеотидов, начинающегося с 3*-конца, эффективность каждой реакции присоединения очередного звена никогда не составляет 100%, то неочищенный продукт будет представлять собой смесь основного продукта и более коротких олигонуклеотидов. Легко подсчитать, что чем длиннее будет синтезируемый олигонуклеотид, тем ниже содержание основного продукта. В связи с этим очищенные праймеры будут давать более лучшие результаты, но очистка праймеров требует дополнительных усилий и значительно увеличивает их стоимость. Что касается коротких модульных праймеров (5-, 6-, 7- или 8-меров) то они, как правило, используются в неочищенном виде по причине довольно высокого содержания основного продукта. Имеются специальные работы, посвященные определению возможности использования неочищенных праймеров как в ручном, так и в автоматическом режимах. Так, было показано, что при эффективности реакции присоединения при синтезе праймеров более чем 98% очистка праймеров становится необязательной . Проведенное детальное исследование большого числа олигонуклеотидных праймеров длиной 25 и 50 звеньев, синтезированных на различных приборах разными операторами, позволило выявить интересные факты . Так, было показано, что при эффективности реакции присоединения свыше 98,5% очистки даже таких протяженных праймеров (25-меров) для целей секвенирования не требуется. В то же время, несмотря на то, что производителями синтезаторов и реагентов для синтеза ДНК гарантируется эффективность присоединения не ниже 98%, отмечаются и более низкие эффективности синтеза, получающиеся как за счет низкого качества реагентов, проблем с самими инструментами, так и ошибок персонала, приводящие к получению праймеров с выходом основного продукта 70% и менее. Весьма удивительным оказалось то, что даже такие праймеры показали вполне приемлемые для чтения секвенирующего геля результаты . Это можно объяснить только тем, что вклад в гетерогенность получаемых полос ДНК при использовании неудовлетворительных праймеров вносит тот олигонуклеотид, который короче, чем основной продукт, всего лишь на одно-два звена, тогда как другие, более короткие, возможно, диссоциируют с матрицы ДНК на этапе построения новой цепи.

Одним из способов выявления гетерогенности синтезированных нуклеотидов может служить их разделение в денатурирующем высокопроцентном (12-20%) полиакриламидном геле после мечения по 5"-концу радиоактивным фосфором с помощью полинуклеотидкиназы фага Т4. Существует также возможность анализа праймеров без применения радиоактивной метки тонкослойной хроматографией на силикагеле и наблюдения их в ультрафиолетовом свете . В исключительных случаях можно рекомендовать определение нуклеотидной последовательности самого праймера методом химической деградации в модификации Данилюка и соавт. [Данилюк и др., 1986].

Автоматический синтез олигодезоксирибонуклеотидов в настоящее время осуществляется с помощью специальных приборов - ДНК-синтезаторов как фосфитамидным , так и Н-фосфонатным методами, пришедшими на смену используемым ранее фосфотриэфирному методу и еще более давнему фосфодиэфирному . Оба современных метода легко масштабируемы и обеспечивают высококачественный скоростной синтез (суммарное усредненное время одного цикла синтеза составляет 40-45 с для Н-фосфонатного метода и от 3 до 4,5 мин для фосфитамидного). Выбор того или иного метода не диктуется синтезатором ДНК, поскольку доступные ныне из коммерческих источников приборы позволяют осуществлять синтез олигонуклеотидов любым из этих методов. Справедливости ради следует отметить, что Н-фосфонатный метод синтеза дает несколько большее число ошибок при синтезе, чем фосфитамидный. Проведенное секвенирование различных праймеров общим количеством 8937 нуклеотидов, синтезированных Н-фосфонатным методом, выявило 37 ошибок или в среднем 1 на 241 нуклеотид . Ошибки по типу распределились следующим образом: 20 делеций, 12 вставок и только 2 замены. Однако в данной работе осуществлялось клонирование и секвенирование преимущественно протяженных олигонуклеотидов, имеющих в длину до 85 звеньев, а, как известно, с увеличением длины олигомера эффективность и точность синтеза снижаются. В то же время при секвенировании двадцати клонов, содержащих два более коротких олигонуклеотида (31- и 36-меры), было выявлено значительное число ошибок, составившее 4 на 680. Схожая работа была проведена и с олигонуклеотидами, синтезированными фосфитамидным методом . Для секвенированных олигонуклеотидов общим количеством 3152 звена было выявлено 10 ошибок, часть которых представляла собой инсерции, делеций и замены нуклеотидов, и последних было все же несколько больше, чем для праймеров, синтезированных Н-фосфонатным методом. Среднее число ошибок составило одну на 315 нуклеотидов. Также различные типы ошибок выявлены при секвенировании 249 звеньев с целью анализа точности синтеза данных олигонуклеотидов фосфитамидным методом .

Многие приборы позволяют осуществлять различный масштаб синтеза олигонуклеотидов, варьирующий обычно от 0,05 до 5 или даже 10 мкмоль. Крупные масштабы синтеза применяются при синтезе праймеров для диагностических целей. Для секвенирования же ДНК масштаб синтеза в 0,05 мкмоль часто оказывается избыточным. В связи с этим был разработан мультиплексный ДНК-синтезатор, позволяющий в автоматическом режиме осуществлять одновременный синтез 96 независимых образцов в полипропиленовом микропланшете с масштабом синтеза всего 0,02 мкмоль или 20 нмоль, что позволило резко снизить стоимость получаемых олигонуклеотидов . Одновременный синтез 10 независимых образцов позволяет производить EMBL ДНК-синтезатор, характеризующийся к тому же экономным расходованием реактивов .

Видимо, здесь, в этом разделе, будет целесообразным упомянуть об относительно недорогом отечественном синтезаторе ДНК ASM-102U, выпускаемым ТОО "БИОССЕТ" (Новосибирск), который вполне способен обеспечить олигонуклеотидными праймерами для секвенирования ДНК и проведения ПЦР любую лабораторию. Однако в настоящее время весьма развит так называемый заказной синтез олигонуклеотидов, включая синтез модифицированных олигонуклеотидных праймеров, несущих какие-либо функциональные группы, что является дешевой альтернативой собственному синтезатору ДНК. Более подробную информацию о синтезаторе ДНК ASM-102U, а также о фирмах, занятых в заказном синтезе олигонуклеотидов, заинтересованный читатель может найти в разделе Отечественные поставщики материалов и оборудования для секвенирования ДНК.

В заключение данного раздела, видимо, стоит упомянуть о химерных олигонуклеотидах, так называемых PNA (Peptide Nucleic Acids), где скелет такой молекулы образуется благодаря наличию N-(2-aMHHO-этил)глициновых остатков и фосфодиэфирные связи между азотистыми основаниями таким образом заменены амидными. Синтезированные достаточно давно , они уже нашли весьма широкое применение в молекулярной биологии и биотехнологии , поскольку оказались способными формировать двойную спираль с комплементарными им обычными олигонуклеотидами, образуя Уотсон-Криковские пары . Однако до последнего времени в литературе не встречалось сообщений об использовании таких PNA в качестве затравочных молекул для ДНК-полимераз. В недавней работе американских авторов была показана принципиальная возможность использования подобных несколько модифицированных PNA в качестве праймера для разных полимераз, включая Кленовский фрагмент ДНК-полимеразы I . Так, первые 19 азотистых оснований этой химеры являлись PNA, тогда как 3"-конец этой молекулы был представлен обычным динуклеотидом со свободной ОН-группой в 3"-положении дезоксирибозы. Удлинение данного праймера сопровождалось включением радиоактивно меченного дЦТФ, приводя к образованию меченых продуктов. Возможность применения подобных праймеров для практических целей в виде затравочных молекул для секвенирования ДНК выглядит несколько проблематично ввиду чрезвычайно прочного связывания PNA с ДНК-матрицей . Однако продолжающийся синтез различным образом модифицированных PNA , может быть, со временем решит эту проблему. Некоторым преимуществом подобных затравочных молекул перед обычными оли-гонуклеотидными праймерами является их устойчивость к действию различных нуклеаз, что может позволить использовать химерные PNA-праймеры с различными ДНК-полимеразами, обладающими по крайней мере 5" → 3"-экзонуклеазной активностью. В то же время, исходя из позиций сегодняшнего дня, это не представляется очень актуальным.

Учебное пособие соответствует государственному образовательному стандарту дисциплин «Экология» и «Физико-химические основы цитологии» подготовки бакалавров по направлению 140400 «Техническая физика». В пособии описываются проблемы репликации ДНК. Излагаются современные представления о строении хромосом, координации в течение клеточного цикла процессов ДНК-метаболизма, а также описываются участвующие в этих процессах белки и рассматриваются механизмы, отвечающие за сохранение генетической стабильности организмов. Предназначено для студентов дневной, очно-заочной и заочной форм обучения, изучающих дисциплины «Экология» и «Физико-химические основы цитологии» в рамках подготовки бакалавров по направлению 140400 «Техническая физика».

* * *

Приведённый ознакомительный фрагмент книги Репликация ДНК: учебное пособие (И. М. Спивак, 2011) предоставлен нашим книжным партнёром - компанией ЛитРес .

Глава 4. Механизм образования и необходимость РНК-праймера

4.1. Синтез праймера для полимеразной реакции

ДНК-полимеразы не могут начинать синтез ДНК непосредственно на матрице, а способны только добавлять новые дезоксирибонуклеотидные звенья к 3"-концу уже имеющейся полинуклеотидной цепи. Такую заранее образованную цепь, к которой добавляются нуклеотиды, называют праймером (или затравкой), она состоит из РНК. Короткую РНК-затравку синтезирует из рибонуклеозидтрифосфатов фермент, называемый ДНК-праймазой. Праймазная активность может принадлежать либо отдельному ферменту, либо одной из субъединиц ДНК-полимеразы. Праймаза связывается с геликазой и ДНК, формируя структуру, называемую праймосомой, и синтезирует РНК-праймер. РНК-праймеры удлиняются действием ДНК-полимеразы III у прокарит и ДНК-полимеразой α у эукариот. Схематически этот процесс на отстающей нити показан на рис. 8. У E.coli праймеры синтезирует специальный отдельный фермент – праймаза.

Рис. 8. РНК-праймеры на отстающей нити

4.2. Понятие об РНК-ДНК дуплексе

ДНК обычно присутствует в клетке в В-форме. Кроме этого, описаны еще две возможные формы состояния ДНК – А и Z. Эти формы представлены на рис. 9. Взаимодействие оснований в В-форме представлено на рис. 10.

У А-формы плоскости оснований составляют угол в 20 градусов с перпендикуляром к оси спирали (у В-формы – 0), расстояние между парами оснований уменьшается до 0.29 нм (у В-формы – 0.34 нм), число пар на виток увеличивается до 11–12 (у В-формы – 10).

Пары оснований в А-форме очень сильно отодвинуты от оси спирали к периферии молекулы – почти на половину радиуса; сдвиг достигает 4–5 Å, а в В-форме ДНК он близок к нулю.

Рис. 9. Возможные формы ДНК

При образовании праймера (подробнее сам процесс его синтеза будет представлен при описании ДНК-полимеразы α эукариот) образуется ДНК-РНК дуплекс, который существует в А-форме. Таким

образом, в А-форме дуплекса обеспечивается оптимальный баланс между гидрофобными и комплементарными взаимодействиями оснований матрицы и праймера.

Рис. 10. Взаимное расположение нуклеотидов в ДНК в В-форме

4.3. Ключевые ферменты, участвующие в синтезе ДНК

Многие известные теперь детали процесса репликации ДНК удалось установить благодаря исследованию поведения и активности ферментов, обеспечивающих работу аппарата репликации. Наиболее полно изучен механизм репликации бактериальной ДНК, особенно ДНК Е. соli и бактериофагов, которые в ней размножаются. Довольно хорошо известны и ферменты репликации дрожжей, Drosophila, млекопитающих.

4.3.1. ДНК-полимеразы

ДНК-подимсразы присутствуют во всех прокариотических и эукариотических клетках. Более того, многие вирусы бактерий и животных индуцируют образование вирус-специфических ДНК-полимераз или белков, способствующих эффективному участию ДНК-полимераз клеток-хозяев в репликации вирусной ДНК.

Многие прокариотические и эукариотические ДНК-полимеразы выделены в чистом виде, а их физические и ферментативные свойства детально охарактеризованы. И хотя эти свойства не совсем идентичны, механизм катализа для всех указанных ферментов в общих чертах одинаков.

Рис. 11. Общий принцип строения ДНК-полимераз.

В первичной структуре ДНК-полимераз эукариот присутствуют консервативные мотивы, гомологичные соответствующим мотивам прокариотических ферментов. Это подтверждает, что все ДНК-синтезирующие ферменты имеют общий план строения. Общий принцип строения ДНК-полимераз показан на рис. 11. По форме ДНК-полимсразы можно уподобить полураскрытой кисти правой руки, в которой ладонь, большой палец и остальные пальцы представляют три основных пространственных домена и формируют полость, удерживающую ДНК-матрицу и затравку в ходе синтеза. Консервативные мотивы А, В и С образуют активный центр в домене «ладони», «пальцы» удерживают однонитевую матрицу, а «большой палец» прижимает праймер – матричный двунитевой участок.

Применительно к различным типам ДНК-полимераз эукариот эта модель может быть модифицирована. ДНК-полимеразы работают совместно с различными белковыми комплексами, удерживающими их в вилке репликации. Чаще всего их называют «зажим» и «загрузчик зажима» («sliding clamp», «clamp loader»).

После объединения ДНК-полимеразы с зажимом, «загрузчик зажима» отходит от места реакции, но держится поближе к отстающей нити, чтобы провести загрузку на новом месте объединения праймер-матрица, как только ДНК-полимераза диссоциирует при завершении синтеза предыдущего фрагмента Оказаки. Этот процесс схематически изображен на рис. 12. Подробно об этих комплексах у эукариот и их роли в репликации будет рассказано далее.

4.3.1.1. ДНК-полимеразы прокариот

Полимеразы прокариот обозначаются римскими цифрами (в отличие от полимераз эукариот, которые обозначаются греческими буквами). Наиболее полно изучена ДНК-полимераза I (Ро11) Е. соli. Она представляет собой одиночный полипептид с мультифуикциональными активностями. В качестве ДНК-полимеразы Ро11 катализирует перенос 5"-дезоксинуклеотидильных единиц дезоксинуклеозид-5"-трифосфатов к З"-ОН-группе в цепи ДНК или РНК, после чего происходит спаривание перенесенного основания с соответствующим основанием комплементарной цепи ДНК. Таким образом, для полимеризации ферменту необходимы праймер в качестве акцептора дезоксинуклеотида и матрица, определяющая присоединение нужного нуклеотида. Помимо полимеризации нуклеотидов, Ро11 катализирует две другие реакции, биологическая роль которых очень важна. В одной из них происходит гидролиз фосфодиэфирных связей в одной цепи ДНК или на неспаренном конце дуплексной ДНК, причем за один акт удаляется один нуклеотид, начиная с 3"-конца цепи (3"-5"-экзонуклеаза). Вторая реакция также состоит в отщеплении нуклеотидов, но гидролиз начинается с 5"-конца двунитевой ДНК в направлении к 3"-концу (5"-3"-экзонуклеаза). Эти различные активности присущи разным сайтам полипептидиой цепи РоlI, Если in vitro обработать РоlI трипсином, то полипептидная цепь расщепится на большой и малый фрагменты. Большой, С-концевой фрагмент («фрагмент Кленова») сохраняет ДНК-полимеразную и 3" -5"-экзонуклеазную активности; малый N-концевой фрагмент обладает только 5"-3"-экзонуклеазной активностью.

РоlI и присущие ей экзонуклеазные активности играют очень большую роль в репликации и репарации хромосомной ДНК Е. соli. 3’-5"-экзонуклеазная активность обеспечивает контроль за присоединением каждого нуклеотида и удаление ошибочных нуклеотидов вновь синтезированной цепи. Если эта активность подавлена в результате каких-то мутаций в гене, кодирующем РоlI, то при репликации генома часто происходят мутации – замены оснований.

Способность ДНК-полимеразы удлинять 3"-конец нити, спаренной с матричной нитью, позволяет ей заполнять пробелы между сегментами отстающей нити. РоlI удлиняет фрагменты Оказаки с 3"-концов и удаляет рибонуклеотиды праймера, с которых начинаются 5"-концы соседних фрагментов, что является необходимой предпосылкой для формирования непрерывной отстающей цепи. Поскольку РоlI способна удлинять 3"-конец одной из цепей в месте разрыва в двунитевой ДНК и удалять нуклеотиды с 5"-конца того же разрыва (процесс, называемый ник-трансляцией), этот фермент играет ключевую роль в репарации поврежденной ДНК. Ник-трансляция широко используется in vitro для синтеза радиоактивно меченой ДНК.

У Е. соli имеются и две другие ДНК-полимеразы, но они присутствуют в клетке в меньших количествах. РоlII присоединяет нуклеотиды значительно менее эффективно, чем Ро11, и не обладает 5"-З"-экзонуклеазной активностью. Следовательно, РоlII может заполнять пробелы между фрагментами ДНК, спаренными с матричной цепью, но не способна отщеплять РНК-нуклеотиды от фрагментов Оказаки или осуществлять ник-трансляцию. Роль РоlII в репликации и сохранении хромосомной ДНК Е. соli до настоящего момента неясна. Вероятно, она может участвовать в восстановлении синтеза ДНК после повреждения и остановки вилки репликации. Такой процесс принято называть ресинтезом.

PolIII-холофермент – это ключевой фермент, ответственный за репликацию хромосомной ДНК Е. соli. В каждой клетке содержится только 10–20 копий PolIII – холофермента, но именно он является основным компонентом мультиферментного полимеразного комплекса, инициирующего формирование репликативных вилок в точках начала репликации, участвующего в элонгации лидирующей цепи в вилке и удлиняющего РНК-праймеры с образованием фрагментов Оказаки. Так как PolIII – холофермент не обладает 5"-3"-экзонуклеазной активностью, для репликации отстающей цепи необходимо участие РоlI, чтобы произошло удлинение продукта, образовавшегося при участии PolIII, и удаление РНК-праймеров на 5"-конце фрагментов Оказаки.

Методом направленного мутационного анализа обнаружены изменения в полипептидной цепи основного (кор) фермента PolIII, и изучены аминокислотные замены, которые позволяют приписать определенные виды ферментативной активности конкретным субъединицам ферментного комплекса. Так, α-субъединица обладает полимеразной активностью, а ε-субъединица – 3" 5"-экзонуклеазной. Однако комплекс α– и ε-субъединиц обладает значительно более высокой полимеразной и экзонуклеазной активностями, чем каждая из соответствующих субъединиц в отдельности. Функция третьей, θ-субъединицы пока неясна.

Помимо субъединиц, составляющих PolIII – кор, PolIII-холофермент содержит еще семь субъединиц: τ,γ,β,δ,δ’,χ, и ψ. Перечисленные полипепгиды также существуют во множестве копий, так что в результате мол. масса полимеразного комплекса составляет примерно 10 3 кДа. Роль β-субъединицы заключается в том, чтобы свести к минимуму вероятность отделения фермента от матрицы до завершения процесса копирования, то есть работает как «зажим». Субъединица τ является фактором димеризации репликативных холоферментов. Точная же функция других субъединиц неизвестна. Вполне возможно, что PolIII-холофермент существует в двух формах, каждая из которых содержит определенный набор вспомогательных субъединиц, придающих ферменту определенные свойства. В одной форме фермент катализирует синтез непрерывной ведущей цепи, а в другой – прерывистой отстающей.

PolIII-холофермент катализирует же реакции синтеза, что и PolI, но работает примерно в 60 раз быстрее. Более того, PolIII-холофермент обладает повышенным сродством к матрице и обеспечивает более высокую эффективность копирования. PolIII-холофермент может связываться и с другими белками, увеличивая эффективность процесса копирования благодаря координации некоторых важных ферментативных этапов репликации. На этом более высоком уровне организации в комплексы могут включаться белки, расплетающие спираль ДНК в точках начала репликации и в репликативных вилках (геликазы), инициирующие образование праймерных РНК (праймазы), обеспечивающие последовательное наращивание цепей ДНК, терминирующие процесс репликации и разделяющие дочерние спирали ДНК.

ДНК-полимеразы, синтезируемые другими бактериями и многими бактериофагами, различаются по своим физической структуре и свойствам. Тем не менее, катализируемые ими реакции практически идентичны реакциям, изученным у Е. соli. У всех ДНК-полимераз есть корректирующая 3"-5"-экзонуклеаза, однако 5"-3"-экзонуклеаза у большинства ферментов отсутствует. Например, ДНК-полимераза фага Т4 может осуществлять 3"-5"-экзонуклеазную реакцию и корректировать ошибки репликации, но не способна катализировать 5"– З"-экзонуклеазную реакцию и поэтому не может обеспечить ник-трансляцию. При репликации ДНК фага Т4 5"-3"-экзонуклеазную реакцию удаления РНК-праймеров перед объединением фрагментов Оказаки катализирует другой кодируемый фагом белок. В процессе прерывистого синтеза отстающих нитей и репарации повреждений ДНК фага Т4 этот фермент работает согласованно с фаговой ДНК-полимеразой. Некоторые вирусы животных (например, герпесвирус, вирус коровьей оспы и вирус гепатита) индуцируют синтез особых полимераз для репликации своих геномов.

Другие вирусы образуют белки, которые стимулируют системы репликации клеточной ДНК или участвуют в репликации вирусной ДНК. Например, паповавирусы синтезируют белки, необходимые для инициации репликации. Аденовирусы человека кодируют белки, «запускающие» инициацию синтеза обеих цепей линейной вирусной ДНК. Они продуцируют также особые ДНК-связывающие белки, облегчающие репликацию.

4.3.1.2. ДНК-полимеразы эукариот

В эукариотических клетках идентифицировано множество ДНК-полимераз, но их физические и функциональные свойства изучены менее детально, чем у соответствующих ферментов прокариот.

Таблица 3

ДНК-полимеразы эукариот

Точная пространственная структура, определенная с помощью рентгеноструктурного анализа, известна лишь для одной ДНК-полимеразы эукариот – полимеразы β-типа, которая заметно отличается по строению от других эукариотических ДНК-полимераз. Сводные данные об основных полимеразах эукариот приведены в таблице 3.

4.3.1.3. ДНК-полимераза α – праймаза

В клетках эукариот синтез ДНК происходит, в основном, в специфических плотных структурах ("репликативных фабриках"), присоединенных к диффузному ядерному матриксу. Предполагается, что в молекулярной организации ядерного матрикса играют некоторую роль фосфолипиды и что ДНК связана с ядерным скелетом гидрофобными взаимодействиями. "Репликативные фабрики" или 21S репликативные комплексы, включают в себя группу ферментов, состоящую не менее чем из 30 белков с молекулярной массой от 15 до 300 кДа, и содержат помимо ДНК-полимеразы α – праймазы еще и 3"-5"-экзонуклеазу, ДНК-лигазу I, РНКазу Н, ДНК-топоизомеразу I, ДНК-геликазу, РСNA и ряд других факторов. Также этот комплекс содержит RРА, специфически взаимодействующий с субъединицей р48 комплекса полимераза-праймаза. Значительный запас ДНК-полимеразы α накапливается в яйцеклетках иглокожих, амфибий, костистых рыб и дрозофилы для обеспечения интенсивной репликации ядерной ДНК в ходе раннего развития.

Как правило, ДНК-полимеразы α не обладают корректорской 3"-5"-экзонуклеазной активностью. Однако в каталитической субъединице 182 кДа ДНК-полимеразы α дрозофилы обнаружена 3"-5"-экзонуклеаза, проявляющая активность только при диссоциации субъединицы 73 кДа.

Мультибелковая форма ДНК-полимеразы α содержит также белок, который связывает динуклеотид диаденозинтетрафосфат (Ар 4 А). Предполагается, что Ар 4 А участвует в репликации ДНК и клеточном делении. Имеются данные о способности ДНК-полимеразы α использовать Ар 4 А в качестве праймера. Однако участие Ар 4 А в качестве праймера in vivo маловероятно, скорее он используется как эффектор. Интересно, что триптофанил-тРНК-синтетаза, синтезирующая этот динуклеотид, находится в том же мултибелковом комплексе.

Обычно комплекс праймаза-полимераза α состоит из четырех субъединиц: большой субъединицы с молекулярной массой 180 кДа, или семейства полипептидов с размерами от 140 до 160 кДа; субъединицы с молекулярной массой около 68–70 кДа и двух малых субъединиц с молекулярными массами 54–58 и 46–50 кДа. Субъединица р180 отвечает за полимеразную функцию. С двумя малыми субъединицами связана праймазная активность. При этом субъединица 48 кДа является каталитической и непосредственно осуществляет праймирование ДНК, а субъединица 58 кДа участвует в связывании инициирующего пуринового нуклеотида и присоединении субъединицы р48 к ДНК-полимеразе α. Она также влияет на скорость полимеризации и стабильность продукта, синтезируемого субъединицей 48 кДа. р58 также облегчает проникновение р48 из цитоплазмы в ядро. Субъединица р180 непосредственно взаимодействует с р58.

С каталитической субъединицей связана субъединица 68–70 кДа, которая необходима для транспорта каталитического полипептида в клеточное ядро. Субъединица 68–70 кДа участвует также в регуляции уровня ДНК-полимеразы α в клетке, она стимулирует синтез каталитического полипептида. Хотя комплекс ДНК-полимераза α-праймаза состоит из четырех субъединиц, количественный состав этого комплекса может быть различным. Вероятно, полимераза α и праймаза находятся в «коре» в соотношении 1: 3.

4.3.1.4. Реакция праймирования

Инициация репликации и прерывистый синтез ДНК на отстающей цепи происходит по РНК-праймерному механизму и является универсальным свойством репликации ДНК у про– и эукариот.

ДНК-праймаза отличается от других РНК-полимераз целым рядом присущих только ей свойств. Во-первых, матричной и субстратной специфичностью. Во-вторых, необычной процессивностью – синтезом мультимеров, кратных 10-нуклеотидным звеньям. В-третьих, низкой точностью и устойчивостью к некоторым ингибиторам РНК– и ДНК-полимераз. Здесь необходимо вернуться к проблеме синтеза РНК-праймеров. Синтез РНК-праймеров на природных матрицах начинается во множественных, но не случайных участках, его инициация происходит с АТР или GТР даже при высоких концентрациях СТР и UTР. Показано, что, например, ДНК вируса SV40 содержат предпочтительные участки инициации – 3"-dСТТТ или 3"-dССС, расположенные внутри участков из 7-25 пиримидиновых нуклеотидов. Высокое соотношение АТР/GТР повышает вероятность инициации в участках 3"-dСТТТ, а низкое – в участках 3"-dССС. Таким образом, концентрация NТР и нуклеотидная последовательность матрицы определяют участки инициации. Впрочем, участки инициации in vivo заметно отличаются от участков инициации, используемых во время репликации ДНК SV40. Во многих случаях обнаружена последовательность 5"-YYYYYYYYСТТТYYYY-3", где Y = С или Т, которая является стартовой площадкой для инициации синтеза ДНК-праймазой в составе комплекса с ДНК-полимеразой α. Минимальная длина пиримидинового кластера должна быть не менее 7 н. Замена одного из пиримидинов на 3"-конце кластера значительно понижает частоту инициации, а замены внутри и вне кластера приводят к смещению точки старта. Известно, что матрицу распознает сама ДНК-праймаза. Стартовый нуклеотид вновь синтезированного праймера всегда является пурином (чаще всего – аденином).

Этот комплекс имеет еще одну специфическую функцию – синтез теломерной отстающей цепи ДНК млекопитающих осуществляет ДНК-полимераза α-праймаза.

ДНК-праймаза – сравнительно медленный фермент. Средняя скорость включения NTP этим ферментом примерно на два порядка меньше, чем скорость включения dNТР ДНК-полимеразой α. ДНК-полимераза α способна удлинять праймеры длиной более 7-10 н. Продукты длиной 2–6 н. не являются субстратами ДНК-полимеразы α и называются абортивными, До синтеза РНК-праймера ДНК-полимераза α и ДНК-праймаза действуют независимо, а после этого их активности координируются. Синтезированный РНК-праймер перемещается в полимеразный активный центр без диссоциации в раствор. Это внутримолекулярное перемещение праймера в дуплексе с матрицей является быстрым и сравнимо по скорости с синтезом праймера. После того как ДНК-полимераза α удлинит праймер, праймаза начинает синтез нового праймера, и цикл повторяется. ДНК-праймаза эукариот отличается от других РНК-полимераз своей способностью к включению дезоксирибонуклеотида в праймер, таким же свойством обладает и праймаза прокариот. Одним из возможных объяснений необходимости включения dNТР в 3"-конец праймера является необходимость перехода от А-формы к В-форме ДНК. Поэтому понимание механизма "переключения" комплекса ДНК-полимеразы α-праймазы от синтеза РНК к ДНК имеет очень большое значение. Способность праймазы узнавать одновременно и рибо-, и дезоксириботрифосфаты представляет серьезный научный интерес.

Выбор РНК-праймера определяется гидрофобным характером белково-нуклеиновых взаимодействий. В случае гибрида РНК-ДНК дуплекс находится в А-форме, в которой обеспечивается оптимальный баланс между гидрофобными и комплементарными взаимодействиями оснований матрицы и праймера.

После инициации рост праймера сопровождается извлечением оснований матрицы из гидрофобной полости белка для спаривания с основаниями растущей цепи РНК. В условиях такой конкуренции короткие ди– и тринуклеотиды легко диссоциируют, образуя абортивные продукты. С ростом длины праймера прочность дуплекса увеличивается, ослабевает влияние гидрофобности активного центра, и пары оснований приближаются к оси спирали. При длине праймера 7 н создаются условия для включения дезоксинуклеотида и перехода в энергетически более выгодную В-форму. Здесь нужно учитывать и большее сродство к ферменту dNТР по сравнению с NТР. Предложенная концепция, по-видимому, носит универсальный характер, поскольку подобное происходит и при инициации транскрипции.

ДНК-полимераза α связывает сначала матрицу, затем праймер и субстрат. ДНК-полимераза α наиболее активна на двунитевой ДНК, содержащей бреши длиной не менее 20–30 н. Область связывания матрицы с ДНК-полимеразой α является достаточно протяженной. Она строго защищает от гидролиза 9 н праймерной цепи, 13 н двухцепочечного участка и 14 н одноцепочечной матрицы и слабо защищает несколько оснований вне этого района. Фермент связывается с 19–20 н матрицы посредством ионных и гидрофобных взаимодействий, эффективность связывания при этом коррелирует с гидрофобностью оснований матрицы.

Отличительной особенностью ДНК-полимеразы α является ее способность удлинять РНК-праймеры и прочная ассоциация с ДНК-праймазой, которая синтезирует эти праймеры.

Средняя процессивность ДНК-полимеразы α составляет 20–50 н. Праймаза редко ошибается в момент синтеза динуклеотида, но затем легко использует неправильные NТР. Хотя скорость включения ошибочных нуклеотидов зависит от нуклеотидной последовательности матрицы и самого неправильного нуклеотида, в принципе, ДНК-праймаза является самым неточным нуклеотид-полимеризующим ферментом. В некоторых случаях один неправильный нуклеотид приходится менее чем на 100 правильных. Встраивание неправильного нуклеотида не препятствует включению следующего правильного нуклеотида. Праймаза может полимеризовать сходные нуклеотиды и генерировать праймеры с множественными ошибками, котрые не ингибируют дальнейший синтез и после внутримолекулярного переноса в ДНК-полимеразный активный центр удлиняются ДНК-полимеразой в присутствии dNTP.

Существуют две модели механизма синтеза праймеров, некомплементарных матрице. Согласно первой модели, фермент просто включает некомплементарные матрице нуклеотиды. Вторая модель предполагает включение нуклеотида, комплементарного матрице, с последующим скольжением праймера относительно матрицы. Низкая точность ДНК-праймазы послужила основой гипотезы о том, почему именно РНК является затравкой при репликации ДНК. Поскольку первые нуклеотиды могут ошибочно включаться в новую растущую цепь, предполагается, что РНК-праймер отмечает "высокоошибочный" участок для последующего вырезания и более точной застройки. Эта точка зрения выглядит убедительной, но, вероятно, главная причина появления РНК-праймера связана все-таки с более эффективной инициацией синтеза ДНК при наличии А-формы РНК-ДНК дуплекса.

Конец ознакомительного фрагмента.