В лабораторной практике при работе с микроорганизмами приходится постоянно принимать меры, чтобы посуда, питательные среды, металлические инструменты, используемые во время работы, не содержали микробов. Для этой цели применяют следующие методы стерилизации:

Стерилизацию перегретым паром под давлением;

Стерилизацию текучим паром;

Стерилизацию горячим воздухом;

Дезинфекцию.

Наилучшим способом стерилизации является обработка различных объектов перегретым паром в специальных аппаратах - автоклавах.

Автоклав и стерилизация перегретым паром под давлением

Автоклавы - это металлические (стальные, чугунные или медные) котлы с двойными стенками и массивной крышкой, герметически закрывающейся с помощью болтов и резиновой прокладки. В зависимости от системы обогрева автоклавы бывают паровые, электрические и огневые (рис. 42). Получение в автоклаве высокого давления и перегретого пара температурой 115-120°С позволяет в течение 20-30 мин уничтожить как вегетативные клетки, так и споры микробов.

В автоклаве стерилизуют все те предметы, которые не портятся при высокой температуре: различные жидкости (воду, питательные среды, не содержащие углеводных компонентов), стеклянную посуду, металлические инструменты, вату, марлю, бумагу и пр.

В тех случаях, когда некоторые вещества не выдерживают нормального режима стерилизации в автоклаве (в частности, питательные среды, содержащие сахара), их стерилизуют в автоклаве при температуре 112 °С в течение 20 мин, а также при более мягких режимах.

При высоких давлениях перегретого пара в автоклаве соответственно возрастает температура нагрева; это вызывает карамелизацию сахаров, добавляемых в некоторые питательные среды, в результате среды становятся непригодными для определения физиологических свойств микробов.

Измерение давления внутри автоклава производится с помощью манометра, вмонтированного в крышку или корпус автоклава. При чрезмерном возрастании давления автоматически срабатывает предохранительный клапан, расположенный в зависимости от конструкции либо на крышке, либо на боковой поверхности стенки автоклава. Струя пара, выходя со свистом из предохранительного клапана, предупреждает о необходимости прекращения нагрева. Если нагрев не прекратить, автоклав может взорваться.

В специальном кармашке на крышке автоклава иногда помещается термометр, с помощью которого измеряется температура стерилизации. Внутри автоклава имеется подставка, под которую наливается вода через трубку с воронкой, расположенную снаружи автоклава. Кроме того, автоклавы снабжаются краном для выпуска пара и воздуха и краном для выливания воды.

Правила обращения с автоклавом при стерилизации следующие: аппарат через воронку и трубку заполняют водой, уровень которой должен находиться ниже подставки. Предметы, подлежащие стерилизации, помещают в специальные металлические бюксы и загружают в автоклав. Крышку автоклава завинчивают.

Открыв кран для выхода пара и воздуха, начинают нагрев. Как только вода закипит, образующийся пар начинает вытеснять из автоклава воздух. Паровыпускной кран держат открытым до тех пор, пока из него сплошной струей не пойдет сухой пар. Это указывает на полное удаление воздуха из автоклава. Тогда кран закрывают. Пар, накапливающийся при дальнейшем нагревании все в большем и большем количестве, повышает давление в автоклаве, а вместе с тем и температуру. При работе с автоклавом можно руководствоваться таблицей соотношений между давлением пара и его температурой (табл. 4).

После того как стрелка манометра достигнет нужного показателя давления (температура в автоклаве при этом будет соответствовать принятой температуре стерилизации), регулируют нагрев автоклава так, чтобы давление держалось необходимое время на одном уровне. По окончании стерилизации прекращают нагревание. Когда температура в автоклаве понизится, а стрелка манометра опустится до нуля (давление в автоклаве сравняется с атмосферным), осторожно открывают паровыпускной кран, выпускают пар и, открыв крышку автоклава, вынимают материал. Открывать паровыпускной кран преждевременно, до падения давления в автоклаве, нельзя. Резкое понижение давления в камере автоклава вызовет бурное вскипание жидкостей, нагретых до более высоких температур, чем 100 °С, т.е. выше точки кипения при нормальном атмосферном давлении. Бурно вскипевшие жидкости будут смачивать или даже вытолкнут ватные пробки из сосудов - работа будет произведена впустую. Питательные среды будут портиться, так как на мокрых пробках легко развивается попадающая из воздуха микрофлора, проникает внутрь и заражает среды. Кроме того, открывать автоклав с повышенным давлением опасно для работника.

Однако как только стрелка манометра остановится на нуле, автоклав нужно открыть тотчас же, иначе конденсат начнет стекать на пробки и также вызовет их смачивание. Чтобы избежать смачивания пробок конденсационной водой, перед стерилизацией их закрывают бумагой.

Материалы, помещенные в автоклав, будут надежно простерилизованы за 20-30 мин, если температура поддерживается 120°С, что соответствует давлению в 2 ат (19,61 * 10000 н/м2) или по манометру в 1 ат сверх нормальной. Автоклав можно с успехом применять и для стерилизации сред текучим паром; в этом случае крышку автоклава не завинчивают.

Кипятильник Коха и стерилизация текучим паром

Кипятильник Коха представляет собой цилиндр из оцинкованной жести или меди с двойными стенками и конической крышкой в виде шлема (рис. 43). В крышке посредине имеется отверстие для термометра. Снаружи кипятильник Коха покрывают слоем теплоизолирующего материала: асбеста, линолеума и пр.

Внутри кипятильника помещена перегородка (подстава), разделяющая внутреннее пространство кипятильника на две секции: верхнюю и нижнюю. Нижняя секция заполняется водой, уровень которой устанавливается по водомерному стеклу: вода не должна покрывать верхней части подставы. В верхнюю секцию кипятильника в решетчатых ведерках, устанавливаемых одно на другое, помещают стерилизуемые предметы. Закрыв кипятильник крышкой, начинают нагревать в нем воду. Началом стерилизации считается момент, когда термометр покажет 98-100°С. При отсутствии термометра началом стерилизации считается момент, когда из отверстия в крышке кипятильника начнет энергично выходить пар. Таким образом, стерилизуемые предметы во время работы кипятильника будут все время находиться в струе текучего пара.

Метод стерилизации текучим паром благодаря его простоте и доступности широко распространен в лабораторной практике. Текучим паром стерилизуют главным образом питательные среды, у которых изменяются свойства при нагревании их выше 100°С: белковые, углеводные и желатиновые. Для этих сред метод стерилизации текучим паром наиболее приемлем.

Недостатком метода стерилизации текучим паром является его продолжительность, так как для полной стерилизации среды необходимо проводить многократное нагревание в кипятильнике в течение определенного времени - от 20 мин до 1,5 ч (в среднем 30-45 мин) в зависимости от объема жидкости с промежутками в 24 ч. Весь промежуток времени между нагреваниями среды рекомендуется выдерживать в термостате при 25-30 °С.

Однократное нагревание в кипятильнике Коха вызывает гибель лишь вегетативных микробных клеток, но споры при этом могут сохраниться. При выдерживании стерилизуемой питательной среды в благоприятных условиях (при комнатной температуре, а еще лучше в термостате) часть оставшихся спор прорастет и до следующего дня превратится в вегетативные клетки. Повторное нагревание вызовет гибель и этих вновь развившихся клеток. Наконец, третье нагревание через сутки выдерживания среды в термостате обеспечит полную стерильность. Такой метод получил название дробной стерилизации. В практической работе вместо стерилизации текучим паром в кипятильнике Коха часто применяют обычную стерилизацию в автоклавах при 112 °С с противодавлением 0,5 ат в течение 15-20 мин.

Сушильный шкаф и стерилизация горячим воздухом

В лабораторной практике для стерилизации микробиологической посуды необходимо иметь сушильный шкаф или так называемую печь Пастера. Принцип устройства сушильного шкафа и печи Пастера одинаков. Печи делаются только прямоугольной формы, а сушильные шкафы могут иметь не только прямоугольную, но и цилиндрическую форму (рис. 44 и 45). В этих аппаратах стерилизация осуществляется горячим воздухом (сухим жаром) при температуре 160 °С в течение 1 ч или при температуре 150 °С в течение 2 ч.

Как печи Пастера, так и сушильные шкафы - это полые внутри аппараты с двойными стенками, с двойными и плотно прикрывающимися дверцами. Снаружи для термоизоляции они покрываются слоем асбеста. Между стенками циркулирует горячий воздух, нагревание которого осуществляется либо электрическими спиралями, либо газовыми горелками. Внутри шкафа имеется несколько (обычно две или три) дырчатых полочек. В верхней части шкафа имеется два отверстия: одно предназначено для термометра, а второе служит для вентиляции. Наиболее удобны электрические сушильные шкафы.

В сушильных шкафах последней конструкции предусмотрены четыре ступени обогрева, которые могут быть включены в действие специальным регулятором, помещаемым на боковой стенке шкафа. Нужная степень обогрева достигается включением одной, двух, трех или всех четырех электрических спиралей, причем последовательность включения спиралей может быть любой.

В сушильных шкафах можно, кроме стеклянной посуды, стерилизовать марлю, вату, хотя все же лучше обрабатывать их в автоклаве, так как при температуре 160 °С они желтеют. Нельзя стерилизовать в сушильном шкафу резиновые изделия, так как они не выносят высокой температуры - становятся ломкими и портятся. Жидкости при 150-160 °С вскипают и меняют свой химический состав.

Чтобы избежать последующего заражения простерилизованных предметов микробами из воздуха, перед стерилизацией их заворачивают в бумагу. Чашки Петри завертываются в бумагу по 2 штуки таким образом, чтобы в обертке не было щелей. Стеклянные трубки и пипетки также заворачивают в бумагу, сначала каждую отдельно, а затем в пачки по 10-20 штук. Заворачивание трубок и пипеток должно быть исключительно аккуратным, полностью предохраняющим их внешнюю поверхность от сообщения с воздухом. Колбы, пробирки, бутылки перед стерилизацией горячим воздухом закрывают ватными пробками и бумажными колпачками.

Нельзя допускать в сушильном шкафу повышения температуры выше 170 °С, так как при такой температуре ватные пробки буреют, а бумажные обертки становятся ломкими и даже обугливаются. Началом стерилизации считается момент, когда термометр покажет 150-160 °С. По прошествии требуемого для стерилизации времени нагревание прекращают. Чтобы предохранить посуду от растрескивания, стерилизовать нужно только сухую посуду и шкаф открывать после стерилизации лишь тогда, когда температура в нем упадет до 50-70 °С. Мелкие лабораторные предметы, например платиновые петли, иглы, пинцеты, ножницы и пр., можно стерилизовать простым прокаливанием на пламени газовой горелки (или спиртовки).

Дезинфекция

К дезинфекции в микробиологической лаборатории приходится прибегать очень часто. Наиболее употребительные дезинфицирующие вещества следующие: 3-5%-ный раствор карболовой кислоты и растворы других высших фенолов, 50-70%-ный раствор этилового спирта, такой же концентрации бутиловый спирт, 4%-ный раствор формалина, 1-2%-ные растворы хлороформа и толуола, 0,5%-ный раствор хлорамина и др.

В микробиологических лабораториях консервных заводов дезинфицируют поверхности столов, посуду, полы, стены помещений. Для дезинфекции поверхности столов можно использовать не только растворы этилового спирта, но и растворы карболовой кислоты.

Дезинфекция канализационных устройств на консервных заводах и других пищевых предприятиях производится 5-10%-ным раствором хлорной извести. Для обеззараживания оборотной стеклянной тары на консервных заводах применяют хлорную воду, содержащую в 1 л не менее 100 мг активного хлора. Для приготовления такого раствора берут хлорную известь, смешивают ее с небольшим количеством воды до получения густой массы молочного цвета. Эту смесь добавляют к воде, тщательно размешивают и оставляют на сутки. Хлорная известь реагирует с образованием гидрата окиси кальция - Ca(OH)2 - и активного хлора. Ca(OH)2 оседает на дно, раствор над осадком после осветления получается прозрачным, зеленоватого цвета. Замачивание тары в таком растворе длится 10 мин. После хлорирования тара должна быть тщательно промыта в проточной воде.

Стерилизацию сухим жаром или горячим воздухом осуществляют в печах Пастера (сушильных сухожаровых шкафах). Печь Пастера - шкаф с двойными стенками, изготовленный из термостойких материалов - металла и асбеста. Нагревают шкаф с помощью газовых горелок или электронагревательных приборов. Шкафы с электрическим нагревом снабжены регуляторами, обеспечивающими необходимую температуру. Для контроля температуры имеется термометр, вставленный в отверстие верхней стенки шкафа.

Сухим жаром стерилизуют в основном лабораторную Посуду. Подготовленную для стерилизации посуду неплотно загружают в печь, чтобы обеспечить равномерный и надежный прогрев стерилизуемого материала. Дверь шкафа плотно закрывают, включают обогревательный прибор, доводят температуру до 160-165° С и при этой температуре стерилизуют 1 ч. По окончании стерилизации выключают обогрев, но дверцу шкафа не открывают до тех пор, пока печь не остынет; в противном случае холодный воздух, поступающий внутрь шкафа, может вызвать образование трещин на горячей посуде.

Стерилизацию в печи Пастера можно проводить при различном температурном режиме и экспозиции (время стерилизации) (табл. 1).

Таблица 1. Режим стерилизации

Жидкости (питательные среды, изотонический раствор хлорида натрия и др.), предметы из резины и синтетических материалов стерилизовать сухим жаром нельзя, так как жидкости вскипают и выливаются, а резина и синтетические материалы плавятся.

Для контроля стерилизации в печи Пастера шелковые нити смачивают в культуре спорообразующих бактерий, подсушивают, помещают в стерильную чашку Петри и ставят в печь Пастера. Стерилизацию проводят при температуре 165° С 1 ч (для контроля часть нитей оставляют при комнатной температуре). Затем простерилизованные и контрольные нити кладут на поверхность агара в чашку Петри или помещают в пробирки с бульоном и инкубируют в термостате при температуре 37° С в течение 2 сут. При правильной работе печи Пастера в пробирках или чашках с питательными средами, куда были помещены простерилизованные нити, роста не будет, так как споры бактерий погибнут, в то время как споры бактерий на нитях, не подвергавшихся стерилизации (контрольные), прорастут и на питательных средах будет отмечен рост.

Для определения температуры внутри печи Пастера можно использовать сахарозу или пищевой сахарный песок, карамелизующиеся при температуре 165-170° С.

Подготовка лабораторной посуды к стерилизации в печи Пастера . Лабораторную посуду (чашки Петри, пипетки градуированные и пастеровские, флаконы, колбы, пробирки) перед стерилизацией необходимо тщательно вымыть, высушить и завернуть в бумагу, иначе после стерилизации она может снова загрязниться бактериями воздуха.

Чашки Петри завертывают в бумагу по одной или несколько штук либо укладывают в специальные металлические пеналы.

В верхние концы пипеток вставляют ватные тампоны, предупреждающие попадание исследуемого материала в рот. Градуированные пипетки заворачивают в длинные полоски бумаги шириной 4-5 см. На бумаге отмечают объем завернутой пипетки. В пеналах градуированные пипетки стерилизуют без дополнительного завертывания в бумагу.

Примечание . Если градуировка на пипетках плохо заметна, ее восстанавливают перед стерилизацией. На пипетку наносят масляную краску и, не дав краске высохнуть, в нее втирают с помощью тряпочки порошок бария сульфата. После этого тряпкой снимают избыток краски, которая остается только в насечках градуировки. Обработанные таким образом пипетки следует сполоснуть.

Острые концы пастеровских пипеток запаивают в пламени горелки и заворачивают в бумагу по 3-5 штук. Заворачивать пастеровские пипетки нужно осторожно, чтобы не обломать запаянные концы капилляров.

Флаконы, колбы, пробирки закрывают ватно-марлевыми пробками. Пробка должна входить в горлышко сосуда на 2 / 3 своей длины, не слишком туго, но и не свободно. Поверх пробок на каждый сосуд (кроме пробирок) надевают бумажный колпачок. Пробирки связывают по 5-50 штук и обертывают поверх бумагой.

Примечание . При высоких температурах бумага, в которую завертывают чашки и пипетки, и вата желтеют и даже могут обугливаться, поэтому каждый новый сорт бумаги, получаемый лабораторией, следует испытывать при принятом температурном режиме.

Контрольные вопросы

1. Что понимают под термином стерилизация?

2. Какими способами проводят стерилизацию?

3. Что стерилизуют прокаливанием на огне?

4. Опишите устройство и режим работы печи Пастера.

5. Что стерилизуют в печи Пастера?

6. Как подготавливают стеклянную посуду к стерилизации?

7. Почему в печи Пастера нельзя стерилизовать питательные среды и предметы из резины?

Задание

Подготовьте к стерилизации чашки Петри, градуированные пипетки, пастеровские пипетки, пробирки, колбы и флаконы.

Это металлический цилиндр с двойной стенкой, снаружи покрытый металлическим кожухом. Он герметичес­ки закрывается массивной крышкой с помощью нескольких винтов. На нем установлен манометр с предохранительным клапаном и паро­отводный кран.

Перед стерилизацией в автоклав наливают через воронку с водо­мерным стеклом дистиллированную воду до указанной на кожухе черты. В стерилизующую камеру загружают материал для стерилиза­ции, закрывают плотно крышкой, завинчивают и включают источник нагрева. При этом пароотводный кран ос­тавляют открытым. Образующийся при кипячении пар проходит между стенками автоклава и через отверстия внутренней стенки попадает в камеру. При нагревании из автоклава через пароотводный кран вначале выходит воздух, а затем пар. Выход непрерывной струей сухого пара свидетельствует о полном вытеснении воз­духа из автоклава: кран закрывают, и с этого момента в автоклаве начинает постепенно повышаться давление, стрелка на манометре поднимается. Началом сте­рилизации считается тот момент, когда стрелка манометра достигает нужного дав­ления.

Рис.3

Показание манометра соответствует определенной температуре пара в автоклаве: 0,50 МПа - 112 °С, 0,1 МПа - 120, 0,15 МПа - 127, 0,2 МПа - 134 °С.

Материал в автоклаве чаще всего стерилизуют при 0,1 МПа в течение 20-30 мин. По окончании стерилизации отключают источник нагрева (стрелка манометра постепенно доходит до нуля). После этого открывают пароотводный кран, выпускают остаток пара. Затем осто­рожно отвинчивают крышку и открывают ее. После полного остывания вынимают простерилизованный материал.

В автоклаве можно стерилизовать посуду, инструменты, питатель­ные среды (кроме желатина и сред с углеводами), перевязочный материал и т. п. При работе необходимо соблюдать правила техники безопасности. К работе допускают лиц, имеющих удостоверение на право пользования автоклавом. Исправность автоклава проверяет инспекция котлонадзора.

Аппарат Коха (рис. 4)- это металлический цилиндр, обшитый снаружи материалом (линолеум, асбест), плохо проводящим тепло. На дно наливают воду, а стерилизующий материал помещают сверху на подставку. Аппарат закрывают конической крышкой, в которой имеются отверстия для термометра и выхода пара. Внизу расположен кран для спуска воды. Стерилизацию проводят текучим паром при 100 °С в течение 30-60 мин. При таком режиме погибают вегетативные клетки спорообразующих и неспорообразующих форм микробов. Дробная стерилизация (трехкратная) по 30-60 мин в течение трех дней с интервалом 18-20 ч позволяет создать условия для прорастания спор в вегетативные клетки и освободиться от них. В промежутки времени между стерилизацией споры прорастают и при последующем прогрева­нии погибают. В аппарате Коха стерилизуют те материалы, которые не выдерживают температуру выше 100 °С (желатин, молоко, углеводные среды и др.).

Белковые среды и сыворотку крови, не переносящие температуру 100 °С, стерилизуют дробно при 56-58 °С в водяной бане.

Сушильный шкаф (печь Пастера) (рис. 5) - это металлический двустенный шкаф, покрытый сверху асбестом. В верхней стенке имеются отверстия для термометра и вентиляции. Нагретый воздух поднимается снизу между стенками и через верхнее отверстие попа­дает внутрь шкафа, где на полках размещен стерилизуемый материал. Стерилизацию проводят сухим жаром при 150 "С в течение 2 ч, при 165-170 °С - 45 мин, при 180 °С - 15 мин. В печи Пастера стерилизуют стеклянную посуду. После стерилизации шкаф отключают от источни­ка нагрева и открывают только после полного остывания.

Бактериальные фильтры используют для стерилизации жидкости без нагревания. К ним относятся свечи Шамберлана, Берке-фельда и асбестовые фильтры (пластинки) Зейтца.

Фильтровальные свечи (рис. 6) представляют собой полые ци­линдры, изготовленные из мелкопористых веществ: каолина с при­месью кварцевого песка (свечи Шамберлана) и инфузорной земли (свечи Беркефельда). Свечи Шамберлана имеют различной величины поры, через которые проходят микробы. Свечи, пропускающие круп­ные бактерии, обозначены буквами L9, L1(bis), L3, средние - L5, L7, самые мелкие - L9, L 11 , L 13 Свечи Беркефельда по пористости обозна­чаются W , N , V (самые крупные поры у свечей с маркой У).

Фильтры Зейтца представляют собой асбестовые пластинки раз­личной величины. При монтировании прибора для стерилизации пластинку помещают на сетку между металлическими дисками (с отверстием в середине), которые плотно прижимают друг к другу винтами. Смонтированный фильтр вставляют через пробку в колбу с боковой отводкой (колба Бунзена) и резиновой трубкой, обертывают бумагой и стерилизуют в автоклаве при 120 °С в течение 20-30 мин.

Для фильтрования материала создают разрежение в колбе Бунзе­на, подсоединяя к ней резиновую трубку с разрежающим масляным ручным насосом Комовского или электровакуумным насосом.

Выполнение работы. Микробы культивируют при оптимальных температурных режимах. Для этого в лабораториях используют воз­душные или водяные термостаты.

(рис. 7) представляет собой металлический шкаф с двойными стенками, между которыми находится слой воды или воздуха. Наружная часть термостата покрыта материалом, плохо проводящим тепло (асбест, линолеум).

Рис. 4, 5, 6.

Внутри термостата расположены полки для размещения посев­ного материала выращиваемых микроорганизмов. Постоянную температуру в термостате поддер­живают с помощью терморегулято­ра, который вмонтирован в верх­нюю крышку термостата. Устройст­во терморегулятора основано на принципе линейного расширения веществ. Терморегуляторы пред­ставляют собой сплав каких-либо двух металлов с различным коэффициентом теплового расширения (латунь, цинк) или металлическую "подушку", наполненную спир­том, смесью спирта и эфира, рту­тью или другими веществами, из­меняющими свой объем при определенной температуре. При нагревании термостата выше установлен­ной нормы металлы расширяются, контакты размыкаются и дальней­ший приток тепла автоматически задерживается. После снижения температуры включается электрический ток и приток тепла возобно­вляется.

Термостат – прибор для поддержания постоянства температуры - применяют для выращивания культур микроорганизмов. Он представляет собой шкаф (рисунок 1), в котором поддерживается в течение длительного времени определенная температура. Оптимальная температура для размножения многих микроорганизмов 37 ºС. Термостаты бывают суховоздушными и водяными.

Сушильный шкаф (печь Пастера) используют для стерилизации сухим жаром посуды, инвентаря и сухих материалов, например крахмала, мела (рисунок 2). Стерилизуемый материал предварительно заворачивают в бумагу и помещают в шкаф так, чтобы он не касался стенок. Стерилизацию проводят при температуре 160 ºС в течение двух часов. Поднимать температуру выше 180 ºС не рекомендуется: ватные пробки и бумага начинают разрушаться (буреют, становятся ломкими). Простерилизованный материал вынимают после отключения и охлаждения шкафа, лучше, когда температура в шкафу сравняется с комнатной.

Прибор для счета колоний (рисунок 3) - полуавтоматический счетчик, снабженный электропером с пружинным устройством, предназначенный для счета колоний бактерий в чашках Петри. Чашку
Петри с колониями бактерий устанавливают вверх дном на растровое стекло. Легкий нажим электропера на участке дна чашки Петри, соответствующем положению колонии, оставляет на стекле метку. При этом держатель поднимается вверх, цепь замыкается, и показания счетчика увеличиваются на единицу. Отсчет количества колоний бактерий производится путем вычисления разности показаний импульсного счетчика до начала отсчета и после его окончания.

Автоклав (рисунок 4) – толстостенный аппарат, предназначенный для стерилизации посуды и питательных сред паром под давлением. Это герметичный котел с двойными металлическими стенками и крышкой. Пространство между стенками (водопаровая камера) заполняется водой. Внутренняя часть (стерилизационная камера) снабжена манометром, предохранительными клапанами и краном для спуска воды и пара. Для создания герметичности автоклав плотно закрывается крышкой с резиновой прокладкой. Применяют для стерилизации питательных сред под давлением от 0,5 до 1,0 МПа в течение 20…30 минут.

1 – корпус; 2 – термометр; 1 – крышка; 2 – корпус;

3 – дверца; 4 – потенциометр; 3 – редуктор; 4 – блок управления;

5 – тумблер; 6 – лампа; 5 – маркировка; 6 – термометр

7 – вентиляционные отверстия

Рисунок 1 – Термостат Рисунок 2 - Сушильный шкаф

1 – столик для чашки Петри; 2 – перо с пружинным устройством;

3 – показатель счетчика; 4 – тумблер для включения импульсного счетчика; 5 – тумблер для включения лампы освещения счетчика

Рисунок 3 - Прибор для счёта колоний микроорганизмов

Стерилизация представлена физическим, химическим, механическим и биологическим методами и различными способами. Целесообразность применения того или иного метода стерилизации и его способов зависит от особенности материала, подлежащего стерилизации, его физических и химических свойств. Продолжительность стерилизации зависит от стерилизуемого объекта, стерилизующего агента и его дозы, температуры и влажности окружающей среды.

Физический метод стерилизации К способам физического метода стерилизации относятся высушивание, сжигание и прокаливание, кипячение, пастеризация и тиндализация, горячий воздух (сухой жар), ультразвук, ультрафиолетовое и радиоактивное излучение, ток высокой частоты, солнечный свет. Наиболее распространенным способом стерилизации предметов, допускающих применение высокой температуры, является стерилизация огнем, горячим воздухом и насыщенным водяным паром под давлением. Огонь используют для сжигания инфицированных предметов, не представляющих какой – либо ценности (ненужные бумаги, старые обои, тряпки, мусор), для обеззараживания мокроты больных туберкулезом, трупов людей и животных, погибших от особо опасных инфекций, а также для обжигания и прокаливания разных предметов. Обжигание и прокаливание широко применяется в микробиологической практике для обеззараживания инструментов, лабораторной и аптечной посуды. Прокаливание в пламени горелки или фламбирование – способ стерилизации, при котором происходит полное обеспложивание объекта, так как погибают и вегетативные клетки, цисты и споры микроорганизмов. Обычно прокаливанием стерилизуют петли, шпатели, пипетки, предметные и покровные стекла, мелкие инструменты и другие зараженные предметы, если их нельзя кипятить. Не рекомендуется стерилизовать прокаливанием ножницы и скальпели, так как под воздействием огня режущая поверхность становится тупой. Одним из наиболее простых и распространенных способов физического метода стерилизации, применяемых в медицинской практике, является стерилизация горячим воздухом (сухим жаром). Сухожаровая стерилизация осуществляется в сушильных шкафах (печах Пастера). Сухой горячий воздух оказывает бактерицидное, вирусоцидное, спороцидное действие и используется в основном для стерилизации изделий из стекла (лабораторная посуда- чашки Петри, колбы, пипетки, пробирки и др.), а также изделий из металла, которые могут быть простерилизованы паром под давлением. Кроме того, сухой жар используется для стерилизации предметов из фарфора и термостойких веществ (тальк, белая глина), а также минеральных и растительных масел, жиров, вазелина, ланолина, воска. Наиболее эффективным режимом для этого способа стерилизации, обеспечивающего гибель вегетативных форм и спор, является температура 160 – 180 градусов в течение 15 минут. Нельзя стерилизовать сухим жаром питательные среди, изотонический раствор, предметы из резины и синтетических материалов, так как жидкости вскипают и выливаются, а резина и синтетические материалы плавятся. Стерилизация насыщенным паром под давлением – это наиболее надежный и чаще всего примеряемый способ стерилизации перевязочного материала, воды, некоторых лекарственных средств, питательных сред, мягкого инвентаря, инструментов, а также для обеззараживания отработанного зараженного материала. В хирургической практике перевязочный материал, халаты хирургов, белье для оперируемого обеззараживают при помощи пара в автоклавах. Стерилизация паром под давлением осуществляется в специальных аппаратах – автоклавах. При автоклавировании происходит полное уничтожение всех микроорганизмов и спор. Метод стерилизации паром под давлением основан на нагревании материала насыщенным водяным паром под давлением выше атмосферного. Совместное действие высокой температуры и пара обеспечивают особую эффективность данного способа. При этом погибают и вегетативные клетки, и споры микроорганизмов. Споры микробов под действием насыщенного водяного пара погибают в течение 10 минут, а вегетативные формы – от 1 до 4 минут. Высокая бактерицидная сила насыщенного пара обусловлена тем, что под воздействием водяного пара под давлением белки микробной клетки набухают и свертываются, в результате чего микробные клетки гибнут. Бактерицидное действие насыщенного водяного пара усиливается при избыточном давлении. Стерилизацию в автоклаве проводят при разных режимах. Так, простые питательные среды (мясо – пептонный агар и мясо – пептонный бульон) стерилизуют 20 минут при 120 градусах (1 атм.). Но при этом режиме нельзя стерилизовать среды, содержащие белки, углеводы и другие легко изменяющиеся от нагревания вещества. Среды с углеводами стерилизуют в автоклаве при 0,5 атм. 10 – 15 минут или дробно текучим паром. С помощью высокой температуры можно уничтожить самые стойкие формы патогенных микроорганизмов (включая и спорообразующие) не только на поверхности обеззараживаемых объектов, но и глубине их. В этом и заключается большое преимущество высокой температуры, как надежного средства стерилизации. Однако, некоторые предметы портятся под действием высокой температуры и в этих случаях приходится прибегать к другим способам и средствам обеззараживания. Полное обеспложивание материалов и предметов, не допускающих применения стерилизации высокой температурой, достигается путем повторно проводимой стерилизации водяным паром в аппарате Коха при температуре не выше 100 градусов. Этот способ носит название дробной стерилизации. Он сводится к тому, что остающиеся неубитыми споровые формы микробов, через сутки в термостате при 37 градусах прорастают в вегетативные клетки, гибель которых наступает при последующей стерилизации данного объекта текучим паром. Обработку текучим паром проводят три раза по 30 – 40 минут. Однократный прогрев материала при температуре ниже 100 градусов известен под названием пастеризации. Пастеризация предложена Пастером и предназначена в основном для уничтожения в основном безспоровых микроорганизмов. Пастеризацию проводят при 60 – 70 градусах от 15 до 30 минут, при 80 градусах от 10 до 15 минут. В микробиологической практике пастеризацией посевного материала часто пользуются для выделения чистых культур спорообразующих микроорганизмов и для выявления способности микроорганизмов к образованию спор. Для жидкостей, теряющих вкусовые и другие ценные качества при воздействии высокой температуры (молоко, ягодные и фруктовые соки, пиво, питательные среды, содержащие углеводы или мочевину и др.) стерилизацию текучим паром проводят при 50 – 60 градусах в течение 15 – 33333330 минут или при 70 – 80 градусах в течение 5 – 10 минут. При этом погибают микробы средней резистентности, а более стойкие и споры сохраняются. Дробная 5 – 6 кратная стерилизация при 60 градусах в течение 1 часа носит название тиндализации. Многие изделия медицинского назначения, изготовленные из полимерных материалов, не выдерживают стерилизации паровым способом по общепринятым режимам. Для многих изделий из – за особенностей, содержащихся в них жидкостей (консервант, лекарственные и другие средства) невозможно стерилизовать общепринятыми способами и методами. Для таких изделий разрабатываются индивидуальные режимы стерилизации, обеспечивающие надежное обеспложивание объектов. Так, стерилизация ротора для разделения крови на фракции проводится водяным паром при температуре 120 градусов в течение 45 минут. Стерильность контейнеров для консервантов достигается при 110 градусах в течение 60 минут. Кипячение – способ стерилизации, применяемый для обеспложивания шприцев многоразового пользования, хирургических инструментов, резиновых трубок, стеклянной и металлической посуды. Стерилизацию кипячением проводят в стерилизаторах. Споровые формы в кипящей воде погибают через 20 – 30 минут. Кипячение в течение 45 минут широко используют для обеззараживания выделений и других заразных материалов, белья, посуды, игрушек, предметов ухода за больными. Горячую воду (60 – 100 градусов) с моющими средствами используют при стирке и уборке для механического удаления загрязнений и микроорганизмов. Большинство вегетативных клеток погибают при 70 градусах через 30 минут. Стерилизация фильтрованием применяется в тех случаях, когда субстраты не выдерживают нагревания, в частности, для сред, содержащих белки, для сывороток, некоторых антибиотиков, витаминов, летучих веществ. Этот прием довольно широко применяется для стерилизации культуральной жидкости, когда необходимо освободить ее от клеток микроорганизмов, но сохранить все содержащиеся в ней продукты обмена в неизмененном виде. Способ заключается в фильтровании жидкостей через специальные фильтры, имеющие мелкопористые перегородки и поэтому задерживающие клетки микроорганизмов. Наиболее широко используются два типа фильтров: мембранные фильтры и фильтры Зейтца. Мембранные фильтры готовят из коллодия, ацетата, целлюлозы и других материалов. Фильтры Зейтца изготовлены из смеси асбеста с целлюлозой. Кроме того, для стерилизации применяются фильтры, изготовленные из каолина с примесью кварцевого песка, из инфузорной земли и из других материалов («свечи» Шамберлана, Беркфельда). Мембранные и асбестовые фильтры рассчитаны а одноразовое использование. При ультрафиолетовом облучении бактерицидный эффект обеспечивают лучи длиной 200 – 450 нм., источником которых являются бактерицидные лампы. При помощи бактерицидных ламп производят стерилизацию ультрафиолетовыми лучами воздуха в лечебно – профилактических учреждениях, боксах микробиологических лабораторий, на предприятиях пищевой промышленности, в боксах по производству вакцин и сывороток, в операционных, манипуляционных, детских учреждениях и др. Ультрафиолетовые лучи обладают высокой антимикробной активностью и могут вызывать гибель не только вегетативных клеток, но и их спор. Солнечный свет вызывает гибель микроорганизмов в результате действия ультрафиолетового облучения и высушивания. Высушивание при помощи солнечного света губительно действует на многие виды микроорганизмов, но действие его поверхностное и поэтому в стерилизационной практике солнечный свет играет вспомогательную роль. В последнее время при лечении ран и ожогов используют в виде гелей покрытия из синтетических и природных полимеров. Для местного лечения ран и ожогов широко применяют полимерные антисептические пленки. В состав их входят такие антимикробные средства широкого спектра действия, как катапол, диоксидин, синий йод, а также сорбит, содержащий глутаровый альдегид. Для стерилизации этих пленок применяется ионизирующее излучение в дозе 20,0 кГр. При промышленном выпуске полимерных антисептических пленок и сорбента стерильность их при таком режиме стерилизации обеспечивается полностью. Радиоактивное излучении убивает все виды микроорганизмов как как в вегетативной, так и в споровой форме. Оно широко применяется для стерилизации на предприятиях, выпускающих стерильную продукцию и стерильные изделия медицинского назначения одноразового пользования, для дезинфекции сточных вод и сырья животного происхождения.

Механический метод стерилизации Механические способы стерилизации позволяют удалить микробы с поверхности предметов. К ним относятся обмывание, вытряхивание, подметание, влажное протирание, проветривание, вентиляция, обработка пылесосом, стирка.

Химический метод стерилизации В медицинской практике в настоящее время все более широкое применение находят пластмассы. Они используются в стоматологии, в челюстно – лицевой хирургии, в травматологии, ортопедии, хирургии. Большинство пластмасс не выдерживают тепловых способов стерилизации паром под давлением и сухим жаром (сухим нагретым воздухом). Применяемые для стерилизации таких объектов растворы спирта, диоцида, тройного раствора не обеспечивают стерильности обрабатываемых изделий. Поэтому для стерилизации изделий из пластмасс используют газовый и радиационный методы, а также растворы химических препаратов. Внедрение в практику лечебных учреждений большого числа изделий из термолабильных материалов способствует внедрению радиационного, газового способов обеззараживания и стерилизации растворами дезинфицирующих средств. При химической стерилизации используют газы и средства из различных химических групп (перекисные, фенольные, галоидосодержащие, альдегиды, щелочи и кислоты, поверхностно – активные вещества и др.). Для использования в быту выпускаются моющие, чистящие, отбеливающие и другие препараты, оказывающие антимикробное действие за счет введения В их состав различных химических веществ. Эти препараты используются для очистки и обеззараживания санитарно – технического оборудования, посуды, белья и пр. Пар формальдегида (пароформ) может применяться в лечебных учреждениях для стерилизации металлических изделий медицинского назначения (скальпели, иглы, пинцеты, зонды, зажимы, крючки, кусачки и др.). Перед стерилизацией парами формальдегида изделия необходимо подвергнуть предстерилизационной очистке и тщательно просушить. При стерилизации каким – либо химическим способом регламент обработки того или иного объекта зависит от особенностей обеззараживаемого объекта, резистентности микробов, особенностей свойств химического препарата, температуры окружающей среды, влажности и других факторов. Так, стерильность металлических инструментов достигается за пять часов выдерживания в герметичной камере с парофомом при температуре не ниже 20 градусов и относительной влажности 95 – 98%, при температуре 15 градусов полная стерильность этих объектов достигается только через 16 часов. Спороцидная активность глутарового альдегида зависит от температуры. Оптимум его действия наступает при температуре 15 – 25 градусов. При повышении температуры активность спороцидного действия этого препарата снижается. Стерилизацию химическим методом применяют несколько ограничено. Чаще всего этот метод используют для предупреждения бактериального загрязнения питательных сред и иммунобиологических препаратов (вакцин и сывороток). К питательным средам чаще всего добавляют такие вещества, как хлороформ, толуол, эфир. При необходимости освободить среду от этих консервантов ее нагревают на водяной бане при 56 градусах и консерванты испаряются. Для консервации вакцин или сывороток используют мертиолат, борную кислоту, формалин.

Биологический метод стерилизации Биологическая стерилизация основывается на применении антибиотиков. Этот метод широко используется при культивировании вирусов.